目的:本研究初步探讨卵泡发育过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)合成受限介导多囊卵巢综合征(PCOS)颗粒细胞(GCs)凋亡的作用机制,为临床上改善PCOS卵泡发育障碍提供潜在的治疗靶点。方法:1.分析PCOS患者卵巢GCs m RNA的差异表达谱:从GEO数据库下载人卵巢GCs转录组数据,对差异表达基因进行生物信息学分析。2.来曲唑联合高脂饮食诱导建立PCOS大鼠模型,通过体重监测、阴道涂片监测动情周期、放射免疫法检测血清睾酮(T)和H&E染色观察卵巢形态等鉴定模型。3.ELISA、Western Blot(WB)分别检测PCOS大鼠卵巢中NAD~+、乳酸的含量,以及卵巢总蛋白的乙酰化水平。4.分析细胞凋亡相关因子(BAX、BCL-2和CASPASE-3)、NAD~+合成关键酶(烟酰胺磷酸核糖基转移酶,NAMPT)、NAD~selleck产品+依赖性去乙酰化酶(沉默信息调节蛋白2,SIRT2)和乳酸合成关键酶(乳酸脱氢酶A,LDHA)在PCOS大鼠卵巢中的表达变化:(1)q RT-PCR和WB检测各组大鼠卵巢中BAX、BCL-2、CASPASE-3、NAMPT、SIRT2和LDHA的m RNA和蛋白水平;(2)免疫组织化学法检测BAX、BCL-2、CASPASE-3、NAMPT、SIRT2和LDHA在大鼠卵巢的表达定位;(3)Pearson相关性分析用于评估NAD~+、乳酸与细胞凋亡相关因子的相关性。5.添加FK866抑制KGN细胞中NAMPT的表达:(1)CCK-8检测细胞活力;(2)流式细胞术、q RT-PCR和WB检测细胞凋亡率及凋亡相关因子的表达;(3)q RT-PCR、WB检测NAMPT、SIRT2和LDHA的表达;(4)ELISA检测细胞中NAD~+的含量;(5)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。6.在293T细胞中过表达LDHA的同时添加FK866抑制NAMPT的表达:(1)免疫共沉淀(Co-IP)技术检测LDHA的乙酰化;(2)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。7.添加AGK2抑制KGN细胞中SIRT2的表达:(1)q RT-PCR和WB检测SIRT2和LDHA的表达;(2)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。结果:1.分析PCOS患者和对照组妇女的卵巢GCs转录组数据后发现:二者共有207个基因在GCs中差异表达,其中上调的基因143个,下调的基因64个;GO和KEGG富集分析发现,糖酵解和烟酸-烟酰胺代谢通路被显著富集,热图聚类分析发现PCOS组中LDHA和SIRT2的表达显著下调。2.与对照组大鼠ML intermediate相比,PCOS组大鼠体重(3VEGFR抑制剂74.12±11.99 vs 270.13±8.67,P<0.01)显著增加,动情周期停滞在间期,血清T水平(4.85±1.48 vs0.25±0.20,P<0.01)明显升高,卵巢中囊性卵泡(11.33±2.42 vs 2.50±1.05,P<0.01)显著增多和黄体数量(3.50±1.05 vs 9.67±1.97,P<0.01)显著减少。3.PCOS组大鼠卵巢组织中NAD~+(0.44±0.04 vs 0.75±0.01,P<0.01)和乳酸(0.39±0.01 vs 0.50±0.03,P<0.05)的含量均显著降低,而总蛋白乙酰化显著增强。4.PCOS组大鼠卵巢GCs中BAX和CASPASE-3的表达显著上调(P<0.05),BCL-2、NAMPT、SIRT2和LDHA的表达均显著下调(P<0.05);通过Pearson相关性分析得出,PCOS大鼠卵巢组织中NAD~+水平与Bax(r=-0.98,P<0.01)、Caspase-3(r=-0.99,P<0.01)的表达呈显著负相关,与Bcl-2(r=0.99,P<0.01)的表达呈显著正相关,且NAD~+与乳酸水平(r=0.93,P<0.01)呈显著正相关。5.NAMPT沉默后,KGN细胞活力降低、凋亡率增高(P<0.05),BAX和CASPASE-3的表达显著上调(P<0.05),BCL-2、NAMPT、SIRT2和LDHA的表达显著下调(P<0.05)。6.在过表达LDHA的基础上沉默NAMPT,LDHA的乙酰化增强和乳酸(6.94±0.20 vs 8.55±0.55,P<0.05)的含量显著降低。7.SIRT2沉默后,KGN细胞中SIRT2、LDHA的表达显著下调(P<0.05),乳酸的含量显著降低(7.08±0.04 vs 7.46±0.18,P<0.05)。结论:PCOS大鼠卵巢中NAD~+和乳酸含量显著降低,GCs的凋亡显著增加。NAD~+合成受限可促进GCs的凋亡,提高LDHA的乙酰化水平并抑制其表达,阻滞糖酵解进程和降低乳酸水平,从而抑制卵泡发育所需的能量供应。