目前研究表明产生自由基NO的一氧化氮合酶(NOS)和产生超氧阴离子(O_2~-)的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)在脊椎动物与无脊椎动物免疫中发挥重要作用,但尚无中华绒螯蟹中有关于NOS与NOX基因结构及其作用机制的研究报道。本研究主要开展了NOS与NOX基因的全长克隆、原核表达获得其重组蛋白,并通过细菌侵染、体外细菌结合与siRNA干扰等实验探究NOS与NOX基因与蛋白在中华绒螯蟹抗菌免疫中的作用机制。结果如下:1.通过RACE技术克隆得到NOS与NOX基因的全长。NOS基因全长5900 bp,包括一个3627 bp的开放阅读框(ORF),编码1208个氨基酸,蛋白理论分子量为136.7 k Da,p I为7.079。NOX基因全长4504 bp,包括3891 bp的开放阅读框(ORF),编码1296个氨基酸,蛋白理论分子量为146.1 k Da,p I为7.18。NOS氨基酸主要含有四个保守结构域,分别为NO合酶结构域,黄素氧还蛋白1结构域,黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域,以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)结合域。NOX氨基酸含有三个保守结构域,分别为Ferric-reduct结构域,黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域,以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)结合域,除此之外还有5个EF-hand结构,以及一个跨膜结构域。BLASTp同源性分析发现,NOS与NOX在不同物种中有高保守性。系统发育分析表明,NOS/NOX与甲壳类动物的NOS/NOX聚集在一起Colforsin核磁,但在系统发育树中与其他CL13900价格无脊椎动物或脊椎动物的NOS/NOX分开。2.构建NOS-p ET-32a~+与NOX-p ET-32a~+重组质粒,并诱导与纯化NOS-HIS与NOX-HIS重组蛋白。进一步对NOS-HIS与NOX-HIS细菌免疫功能研究发现,将NOS-HIS和NOX-HIS分别与四种不同的细菌(包括两种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌)进行体外孵育后,两种重组蛋白分别能以不同的结合能力与细菌结合。其中,NOS-HIS蛋白与枯草芽孢杆菌的结合能力最强,其次是金黄色葡萄球菌和嗜水气单胞菌,与副溶血弧菌的结合能力最弱;而金黄色葡萄球菌与NOX-HIS蛋白的结合能力最强,其次是枯草芽孢杆菌,与副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的结合能力较弱。说明重组蛋白NOS-HIS和NOX-HIS是具有细菌结合能力的,而且其与革兰氏阳性菌的结合能力优于革兰氏阴性菌。3.嗜水气单胞菌刺激后检测血细胞中NOS与NOX基因的表达及血清中相关酶活性和含量的变化。嗜水气单胞菌刺激后中华绒螯蟹NOS的基因表达与酶活性变化都显著上调,其中NOS表达在3 h与6 h发生极显著上调(P<0.01),酶活性在6 h显著上调(P<0.05)。中华绒螯蟹NOX的基因表达与酶活性变化都显著下调,NOX表达在24 h发生极显著下调(P<0.01),NOX酶活性在12-48 h酶活性在12 h发生显著下调(P<0.05)。细菌刺激后血清NO、H_2O_2与O_2~-都出现开始显著下降再显著增加的变化趋势。说明机体在细菌侵染后引起NOS基因表达及酶活性的上调,以及引起NOX基因表达与酶活性的下调,使其发生一系列作用产生自由基分子(NO,O_2~-与H_2O_2),进而发挥抗菌免疫。4.Peroxinectin siRNA干扰后检测血细胞中NOS与NOX基因的表达。Peroxinectin siRNA干扰后,在嗜水气单胞菌刺激的第0 h(即Peroxinectin siRNA干扰的第48 h),中华绒螯蟹血细胞中NOS与NOX基因的表达也发生极显著下调(P<0.001)。随着嗜水气单胞菌侵染时间的增加,血细胞中NOS基因的表达也增加,24 h升至最高(P<0.05)Direct genetic effects。NOX基因的表达在12 h实验组(PXN siRNA+嗜水气单胞菌组)显著高于(P<0.05)阴性对照组(NC+嗜水气单胞菌组),在24 h实验组极显著高于(P<0.01)阴性对照组。这说明NOS与NOX基因发挥抗菌功能会受到上游Peroxinectin调控。综上所述,本研究表明中华绒螯蟹NOS与NOX在进化过程中相对保守,NOS-HIS与NOX-HIS重组蛋白能与不同的细菌以不同的结合能力进行结合。在机体受病原体刺激时,可以通过Peroxinectin形成的复合物调控,引起NOS与NOX基因表达变化,从而影响其酶活性变化,使其发生一系列作用产生自由基分子(NO,O_2~-与H_2O_2),进而发挥抗菌免疫。