目的:研究P2X_7受体(P2X_7 receptor,P2X_7R)在视网膜小胶质细胞衰老中的作用;探讨小胶质细胞衰老在青光眼视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)损伤中的作用。方法:采用病例对照研究,选取24例原发性开角型青光眼患者(简称为青光眼组)及24例晶状体混浊程度与青光眼组相匹配的年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)患者术前取房水标本。通过增强型ATP测定试剂盒检测各组患者房水(aqueous humor,AH)中三磷酸腺苷(adenosine Triphosphate,ATP)浓度。并且将GEO数据库的GSE26299数据集研究对象分为P2X_7R高表达组和低表达组进行GO富集分析。我们采用STM2457说明书前房微珠注射分别建立老年鼠(20月龄)和年轻鼠(2月龄)慢性高眼压(chronic ocular hypertension,COH)体内模型,进行眼压和对比敏感度检测COH小鼠视功能,同时对模型小鼠视网膜组织进行冰冻切片免疫荧光染色,观察小胶质细胞形态改变。随后,采用P2X_7R特异性激动剂Bz ATP作用于体外培养的小胶质细胞,模拟COH体外模型,检测小胶质细胞中衰老相关标记物β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)的活性;使用蛋白质印迹(western blotting,WB)、定量实时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测衰老相关蛋白、线粒体自噬canine infectious disease相关蛋白的表达以及衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)分泌量的变化。谷氨酸(glutamate,Glu)刺激原代培养的RGC,模拟COH中RGC的损伤模型。经Bz ATP刺激后小胶质细胞各组培养液作为条件培养基加入含谷氨酸的RGC中培养24h,利用活/死细胞成像试剂盒和q RT-PCR检测各组RGC存活率。最后,使用CSF1抑制剂PLX5622清除老年鼠COH模型中的小胶质细胞,制备带GFP荧光的年轻小鼠骨髓细胞,经尾静脉注入老年鼠COH模型,观察骨髓移植后视网膜小胶质细胞重新募集情况,并且观察其对老年鼠COH模型RGC存活率的影响。结果:在我们的患者队列中,老年组和青光眼组患者房水中ATP浓度升高。来自GSE26299数据集的RNA-seq数据显示,P2X_7R在青光眼小鼠视网膜组织中的表达上调,功能富集分析显示P2X_7R与细胞衰老密切相关。我们建立的老年鼠和年轻鼠COH模型可成功维持6周,并且随着建模时间延长,小鼠对比敏感度下降。并且与年轻鼠COH模型相比,老年鼠COH模型中RGC数量减少更严重。我们通过免疫组织染色发现,与年轻鼠相比,老年鼠视网膜小胶质细胞特异性标记物Iba1分别与衰老相关标记物P53、γ-H2AX共标增加。以上说明老年个体视网膜中小胶质细胞发生衰老,可能是加速老年鼠COH模型RGC损伤的重要原因。我们进一步探索ATP-P2X_7R通路在视网膜小胶质细胞衰老中的作用及机制。体外实验发现,在50μM Bz ATP刺激小胶质细胞24小时后,SA-β-Gal活性增加,衰老相关标记物P53、P21和P16蛋白表达量明显增加,线粒体自噬相关标记物PINK1、Parkin和LC3B表达减少,TIM23表达增加,小胶质细胞吞噬能力下降;而添加P2X_7R特异性抑制剂A438079逆转了该效应,并且在添加线粒体自噬激动剂CCCP或PINK1过表达的小胶质细胞中,Bz ATP-P2X_7R介导的小胶质细胞衰老效也被逆转,这说明Bz ATLY2157299生产商P-P2X_7R通过抑制PINK1介导的线粒体自噬途径促进小胶质细胞衰老。在此基础上,我们发现PINK1过表达的小胶质细胞SASP分泌增加。与Glu组相比,经Bz ATP刺激后小胶质细胞培养液作为条件培养基共培养的RGC存活率更低,而含有PINK1过表达的小胶质细胞培养液均可以有效提高RGC存活率。此外,尾静脉注射年轻小鼠的骨髓细胞后,老年鼠COH模型中发现有小胶质细胞生成,减少老年鼠COH模型中RGC的死亡,具有保护RGC的作用。结论:ATP-P2X_7R通过抑制PINK1介导的线粒体自噬途径诱导小胶质细胞衰老;阻断小胶质细胞衰老或者小胶质细胞移植替代衰老的小胶质细胞,具有保护RGC的作用,可减少老年COH小鼠RGC损伤,为青光眼及衰老的免疫和靶向治疗提供前期基础。