ALK抑制剂

稻瘟病是最重要的水稻病害之一,可导致水稻减产甚至颗粒无收,严重威胁我国粮食生产安全。植物的内源micro RNA(miRNA)是长度为20～24 nt的单核苷酸链,是一类调节植物生长和对胁迫响应的非编码小RNA。在前期实验中,我们发现水稻miR439负调稻瘟病抗性,但是否协同调控水稻产量性状,以及其相关下游机制并不清楚。本论文中,我们首先系统分析了抑制miR439功能的转基因材料(MIM439)和miR439过表达材料(OX439a)在田间的农艺性状;筛选鉴定了miR439下游的靶基因;构建了靶基因的突变体材料和靶位点突变的过表达材料,以及MIR439的突变体材料。通过对以上材料进行抗病性分析,并考察其在田间的表型及农艺性状,我们获得如下研究结果:1、抑制miR439的功能可提高水稻单株产量。OX439a株高变矮,粒长粒宽增加,但粒厚降低,千粒重无显著变化,穗长降低,每穗粒数和结实率降低,单株产量显著降低。同样,MIM439株高变矮,但有效分蘖数显著增加GDC-0068,而且基本不影响穗长、每穗实粒数、结实率和千粒重,提高了单株产量。2、抑制miR439的功能在大田实验中能增强稻瘟病抗性,减少产量损失。稻瘟病病圃产量检测实验分析发现,与对照大田的产量相比,MIM439株系的产量减少明显低于对照NPB;OX439a株系的产量下降显著高于对照NPB。3、突变MIR439增强水稻抗病性并影响部分农艺性状。在优质恢复系YH2115背景下突变MIR439,获得突变体材料。对突变体材料进行抗病性分析发现,YH2115突变体材料稻瘟病和纹枯病抗性增强,但白叶枯抗性与对照YH2115相比无显著差异。突变MIR439导致粒宽和千粒重降低,但每穗实粒数略微增加,单株产量增加不显著。4、miR439抑制靶基因OsSTB1.4、OsWAKL14和OsPR5的表达。从靶基因预测网站筛选可能的靶基因并进行验证。OsSTB1.4(编码枯草蛋白酶)和OsWAKL14(编码细胞壁相关受体激酶)在OX439a株系中下调。烟草瞬时表达系统实验结果表明,带YFP标签的OsSTB1.4,OsWAKL14及OsPR5(编码PR5蛋白家族类甜蛋白)融合蛋白表达量随MCobimetinibIR439a量的增大而减少,证明miR439抑制这三个靶基因的表达。5、靶基因调控水稻抗病性和产量性状。靶基因响应稻瘟菌侵染,在感病材料及抗病材料中OsSTB1.4和OsWAKL14的表达模式存在差异。通过病圃自然发病和实验室离体划伤接种方式接种稻瘟菌,实验结果表明三个靶基因的突变体均更感稻瘟病;相反,过表达OsSTB1.4和OsWAKL14的转基因材料稻瘟病抗性增强。此外,突变OsWAKL14提高对白叶枯病菌的感病性,突变OsSTB1.4、OsPR5对白叶枯病抗性无显著影响。突变靶基因OsPR5、OsSTB1.4使穗长变短。6、“miR439-靶基因”模块调控水稻PTI抗性反应。利用RNA-seq数据分析MIM439与NPB材料的基因表达差异,发现抑制miR439的功能能够促进水稻中响应几丁质及细菌的相关信号通路及防御基因表达,说明miR439可能负调水稻基础抗性或PTI抗性。活性氧(ROS)爆发实验结果证明OX439a抑制ROS爆发,MIM439增强ROS爆发,说明miR439负调控PTI反应,而抑制miR439的功能增强PTI反应。靶基因OsSTB1.4和OsWAKL14增强ROS爆发,并且可以恢复miR439抑制的ROS。综上所述,miR439负调稻瘟病抗性且降低水稻产量。相反,抑制miR439的表达增强稻瘟病抗性并提高水稻产量。在YH2115背景下突变MIR439可增强稻瘟病和纹枯病抗性。miR439的靶基因OsPR5、OsSTB1.4和OsWAKL14正调稻瘟病infection (gastroenterology)抗性,并增强PTI信号。靶基因OsPR5、OsSTB1.4突变体穗长变短。这些实验结果提示miR439通过靶基因OsPR5、OsSTB1.4和OsWAKL14调控稻瘟病抗性和水稻农艺性状。我们的研究结果为水稻高产抗病研究提供了新的理论基础和备选基因资源。

全球化石能源的持续消耗带来了CO_2大量排放导致的温室效应及能源短缺问题,将CO_2作为资源制备燃料及化学品可以形成碳循环经济,实现CO_2减排和资源再利用的双重目标,因而CO_2转化利用势在必行。微生物发酵转化CO_2定向产酸技术是一种新型CO_2转化利用技术,能够低成本,高选择性地将CO_2转化为高价值羧酸化学品。但是此技术通常存在反应路径复杂,速率慢以及效率低等问题。本研究针对以上问题,提出化学催化与生物催化有机结合的催化剂与微生物耦合体系,利用固体催化剂对CO_2高效吸附活化性能加速微生物体系制备中链羧酸(C6-C12)的效率。基于以上,本研究以微生物发酵转化CO_2定向产酸为主要目的,展开系列条件探究实验确定较适宜CO_2定向产中链羧酸运行条件,并在此条件下构建催化剂耦合微生物反应体系,继而通过催化剂表征与微生物宏组学分析进一步阐明耦合体系的调控机制。本文所得结果如下:(1)研究了适宜的CO_2定向产中链羧酸运行条件。首先本研究开展了H_2/CO_2气体比例为4:1、2:1、1:1、1:2及1:4的系列实验。结果表明H_2/CO_2比为2:1反应器中获得最优产中链羧酸性能,其中最大己酸产量为1303.4 mg/L,是其他气体比例反应器的2.5-3.6倍。结合产酸过程关键酶丰度,2:1反应器中与H_2利用相关的氢化酶和与CO_2转化相关的甲酸脱氢酶丰度最高,说明2:1条件下对气体的利用效率最高。随后本研究开展了分别在25 ~oC和35 ~oC下p H为4、5、6、7、8、9和10的系列实验。结果表明35 ~oC时p H为6的条件下制备中链羧酸性能最优,同时高通量测序结果表明此条件下碳链延长功能微生物丰度最高,与产酸结果相互印证。综上,适宜的产中链羧酸条件如下:Ipatasertib临床试验H_2/CO_2比例为2:1以及35 ~oC下p H为6。(2)在适宜产酸条件下,成功构建了催化剂耦合微生物反应体系。耦合体系中最大己酸产量为2701.1 mg/L,乙酸产量为13895.5mg/L,分别较空白组提升93.2%和50.7%;固碳总量为1927.1 m L,是空白组的1.9倍。因此,从产物生成和气体消耗方面Pt/Fe_2O_3催化剂对微生物制备中链羧酸体系具有优异的调控作用。(3)明确了催化剂的调控机制与微生物的代谢机理。首先通过XRD,N_2吸附-脱附分析,XPS等手段测试分析了催化剂的物相组成、结构特征和表面化学状态。通过原位漫反射傅里叶红外光谱对通入CO_2后催化剂表面吸附物种经时变化情况进行分析,结果表明在催化剂表面发现了丙酮酸物种的生成。结合微生物宏组学分析可知丙酮酸进入微生物体内一步更多转化为乙酰辅酶A,与传统乙酰辅酶A合成路径的八个步骤相比,本研究中搭建的丙酮酸转化路径显著提升了微生物代谢速率。乙酰辅酶A继而经由逆β氧化途径将短链羧酸延长为己酸等中链羧酸。关键物种Anaerosalibacter sp.Marseille-P3206是丙antibiotic antifungal酮酸转化及碳链延长途径中最重要的功能微生物。

草莓果实酸甜多汁、营养可口,深受大众的喜爱。但其极易遭受机械损伤和病原微生物感染而发生腐烂,使草莓在贮运保鲜过程中损失严重。为了减少病害造成的损失、提高质量,化学杀菌剂被广泛应用,但由于化学杀菌剂存在耐药性的问题,同时农药残留可能会引发一系列的食品安全问题,所以,化学杀菌剂的使用受到了一定的限制。因此草莓果实采后如何抑制病原菌的侵染成为急需解决的问题。本论文以我国广泛种植的经济性果实草莓为实验材料,以激发子(BTH和BR)诱导的采后草莓果实抗病反应中TGA与NPR1Bemcentinib细胞培养蛋白、FvFLS2/FvBAK1/FvBIK1受体复合物的调控作用以及互作机制为主线,研究NPR1蛋白和FvBAK1转录因子在草莓果实抗病网络中的调控作用,研究结果如下:(1)研究了草莓TGA家族的鉴定及与NPR1蛋白的相互作用分析。结果显示,在四倍体森林草莓(Fragaria vimmune sensoresca)的基因组数据库中检索得到17个草莓TGA家族成员,其不均匀分布在草莓的7条染色体上,基因长BAY 73-4506溶解度度大部分都介于6～7.96 kb,可编码蛋白长度为147～545 aa,分子量为17.04～60.29 kD,等电点为5.77～8.92,不稳定系数为39.05～67.1,脂肪指数为50.44～96.28。这些编码蛋白大多为不稳定亲水性蛋白,不含跨膜结构域,且都是核定位蛋白。根据草莓系统进化树,将其分为5个亚族,草莓TGA家族成员主要聚类在Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ亚族上,少数聚类在Ⅲ亚族上。草莓TGA家族成员启动子顺式作用元件具有相似性,均含有胁迫应激响应元件和植物激素应答元件。FaNPR1蛋白的基因保守结构域上含有BTB结构域和3个ANK重复序列,氨基酸序列中含有一个核定位信号和7个二硫键。可以推断,BTH处理草莓果实可诱导SAR反应和提高细胞还原势,进而FaNPR1蛋白由细胞质转入细胞核与草莓TGA转录因子相互作用,启动下游PRs基因的表达,激活了priming防御反应增强了草莓果实抵御病原菌入侵的防御抗病能力。(2)研究了BR处理对采后草莓果实腐烂和品质的影响。结果显示,5μM～50μM的BR诱导子可以抑制草莓果实采后的腐烂现象,特别是浓度为10μM的BR可以显著限制灰葡萄孢霉的发展。自然腐烂在贮藏后期急剧增加,B.cinerea对草莓果实的侵染性较强,BR处理可以显著降低了草莓果实的发病率及病斑直径,同时降低灰霉病的侵染速度。B.cinerea的侵染严重影响了草莓果实的采后贮藏品质,BR处理可以控制TA、TSS、硬度及相应感官品质的下降,同时促进总花色苷、总酚等抗氧化物质含量的积累,加快DPPH自由基清除率的上升,有效提高了草莓果实的抗氧化能力,提高采后果实的整体品质。这些结果说明,BR处理对采后草莓果实采后腐烂和品质具有一定的影响,BR可以诱导提高草莓果实的抗病性,从而减轻灰霉病的发生。在草莓的保鲜上选择恰当浓度的BR处理十分重要,因为不同的果蔬和组织对BR处理的浓度和方式要求略有不同,因此在绿色激发子BR的应用上,探索适当的浓度和处理方式会使其在保鲜领域具有更好的发展前景。(3)研究了FvFLS2和FvBAK1的受体样激酶复合物参与BR诱导的草莓果实采后免疫。结果显示,FvFLS2、FvBAK1和FvBIK1是三个质膜定位激酶,它们参与BR诱导草莓果实抗性的过程,根据酵母双杂交试验,FvBAK1在酵母细胞中与FvFLS2、FvBIK1和FvRBOHD发生物理相互作用。在接种BR诱导下,草莓果实中NPR1、PR1、PR2和PR5基因及ROS都不断积累增加。在B.cinerea侵染期间,BR处理的草莓果实中ROS爆发和SA依赖的防御反应增强。BAK1的过表达促进了ROS的积累和BR诱导的防御反应,而BAK1功能缺失的突变体则损害了BR诱导的SA信号传导和对坏死性真菌病原体的免疫。BAK1、SA信号通路和BR诱导的对B.cinerea的疾病抗性呈正相关。这些结果说明,FvBAK1与下游底物BIK1进一步形成受体复合物,并根据B.cinerea诱导的PTI反应诱导RBOHD转录。FvBIK1和FvRBOHD之间的相互作用有助于FvRBOHD依赖的ROS爆发,该ROS在暴露于坏死真菌的采后草莓果实PTI反应过程中增强SA信号。说明了FvBAK1作为FvBIK1上游调控因子和FvFLS2共受体在建立草莓果实采后PTI信号转导中的重要性。

顺铂和其他经批准的第二代药物是癌症化疗常用的金属配合物,但因其毒副作用大和耐药性等不良反应,在临床应用中受限。为了克服铂配合物的这些局限性,以具有生物活性喹啉生物碱母体结构为先导化合物,通过引入具有良好水溶性和生物活性的2-乙基吗啉、乙醇基、葡萄糖基、氨基、卤素等功能团,合成喹啉衍生物并与金属离子化合得到相应金属配合物,对其抗肿瘤活性及作用机制进行研究。主要内容如下:1、为了阐明具有喹啉基本结构的白叶藤碱锌(Ⅱ)配合物在抗增殖过程和分子信号通路中的抗癌作用机制,本研究合成了三个白叶藤碱衍生物QA1、QA2和QA3配体,并与锌(Ⅱ)反应制备出三种新型白叶藤碱锌(Ⅱ)配合物[Zn(QA1)Cl_2](Zn-1))、[Zn(QA2)Cl_2](Zn-2))和[Zn(QA3)Cl_2](Zn-3),并评价了它们的抗癌活性。通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)研究了三个配合物对卵巢癌SK-OV-3癌细胞、顺铂耐药卵巢SK-OV-3/DDP癌细胞和正常HL-7702细胞的抗癌活性和细胞毒性。研究发现,三个配合物均对顺PF-03084014分子式铂耐药卵巢SK-OV-3/DDP癌细胞的抗癌活性,其IC_(50)值分别为1.81±0.50、2.92±0.32和1.01±0.11μM;明显高于Zn Cl_2、临床药物顺铂和QA1–QA3配体。此外,三个配合物对正常细胞的毒性比较小,说明它们对SK-OV-3/DDP癌细胞具有靶向选择性。体内抗癌实验结果显示,糖基化白叶藤锌(Ⅱ)配合物Zn-3的体内抑瘤率高达58.2%,具有很强的抑制肿瘤生长的能力,且对小鼠的毒副作用低。抗癌机制实验研究表明,Zn-1–Zn-3通过线粒体自噬诱导SK-OV-3/DDP细胞凋亡,其诱导能力为Zn-3>Zn-1>Zn-2。总之,糖基化白叶藤碱锌(Ⅱ)配合物在开发克服顺铂耐药卵巢SK-OV-3/DDP细胞的化疗药物方面有一定的潜力。2.基于8-羟基喹啉金属配合物具有良好的抗癌活性,本文以2-氨基-8-羟基喹啉(H-AQ)为配体,1,10-菲咯啉衍生物(4,7-二氯-1,10-菲咯啉(L1)、5 5′-二甲基-2,2′-联吡啶(L2)、5-氯-1,10-菲咯啉(L3)、4,4′-二甲氧基-2,2′-联吡啶(L4)、5-氨基-1,10-菲咯啉(L5)、1,10-邻菲咯啉(L6)、2,9-二甲基邻菲咯啉(L7)和4,7-二苯基-1,10-菲咯啉(L8))为辅助配体,与Ni Cl??6Panobinostat作用H?O反应,合成八种新型镍(Ⅱ)配合物[Ni(AQ)_2(L1)](Ni-1),[Ni(AQ)_2(L2)](Ni-2),[Ni(AQ)_2(L3)]?3CH_3OH(Ni-3),[Ni(AQ)_2(L4)]?3CH_3OH(Ni-4),[Ni(AQ)_2(L5)]?CH_3OH(Ni-5),[Ni(AQ)_2(L6)](Ni-6),[Ni(AQ)_2(L7)]?2CH_3OH(Ni-7)和[Ni(AQ)_2(L8)]?3CH_3OH(Ni-8)。通过红外、质谱、元素分析、X-单晶衍射等分析手段对配合物Ni-1–Ni-8进行表征。结果显示,配合物Ni-1–Ni-8的中心原子镍(Ⅱ)离子均与一个N–N供体L1–L8配体和两个去质子化的N–O供体AQ配体进行螯合配位,形成六配位的八面体构型。CCK-8实验结果显示,Ni-8对SK-OV-3/DDComplete pathologic responseP细胞的抗肿瘤疗效高于H-AQ、L1–L8、Ni-1–Ni-7和顺铂。此外,Ni-6和Ni-8能诱导SK-OV-3/DDP细胞凋亡,其凋亡率分别为17.62%和18.25%;并通过诱导线粒体功能障碍抑制SK-OV-3/DDP癌细胞生长,Ni-8的抑制效果高于Ni-6。3.分别以5-溴-8-羟基喹啉(H-BrQ)和8-羟基喹啉(H-Q)为配体,合成了2个钴(Ⅲ)配合物[Co(Br Q)_3](Co-1)和[Co(Q)_3](Co-2)。通过红外、单晶X-射线衍射和元素分析对配合物Co-1和Co-2的结构进行表征。配合物Co-1和Co-2的中心原子钴(Ⅲ)离子分别与三个去质子化的N–O供体Br Q或Q配体螯合,呈现六配位的八面体构型。CCK-8实验结果表明,配合物Co-1和Co-2对顺铂耐药的SK-OV-3/DDP癌细胞显示出较强的细胞毒性,IC_(50)值在微摩尔范围(0.27-9.57μM)内;Co-1对SK-OV-3/DDP癌细胞的抗肿瘤疗效高于H-Br Q、H-Q、Co-2和顺铂。

【目的】从云南烟草黑胫病高发区烟草根际土壤分离对烟草黑胫病菌具有高效拮抗作用的菌株，明确拮抗菌株的分类地位，并进行体外拮抗机理初探，为烟草黑胫病的防治提供生防资源和参考依据。【方法】采用平板对峙法从烟草根际土壤中分离对烟草黑胫病菌具有拮抗作用的菌株，通过生理生化特性及16S rDNA序列分析对具有较强拮抗活性的菌株进行鉴定，并测定生防细菌在体外对烟草疫霉的生物防治活性及作用方式。【结果】从采集的烟草根际土壤样品中共分离出6株对烟草疫霉具有拮抗活性的细菌菌株，其中菌株CD-1表现出最强的拮抗活性，其抑菌带宽度达10.12 mm；根据生理生化特性和16S rDNA序列分析，将该菌株鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。菌株CD-1具有广谱抗真菌特性，其胞内和胞外均存在抗真菌物质，其中使用二氯甲烷作为细菌发酵液萃取剂所提取的抗真菌SB431542分子量物质的抑制效果最好；在p H 6～8、温度40～80℃时表现出相对稳定的抑制活性；菌株CSGLT抑制剂D-1在NB培养基中培养的上清液提取物和细胞提取物对烟草疫霉均表现出较强的抑制活性，其抑ruminal microbiota制率分别达76.91%和67.23%；菌株CD-1分泌的抗真菌物质能破坏烟草疫霉的孢子质膜，抑制孢子萌发，其中以抗真菌粗提取物0.4 mg/mL处理烟草疫霉孢子6 h后的孢子失膜率达53.62%，孢子萌发被完全抑制，同时检测到有明显的离子和核酸渗漏。【结论】地衣芽孢杆菌CD-1产生的代谢产物抗菌谱广，抑菌活性强，具有开发成生防菌剂的潜力。

为丰富磷高效小麦遗传资源，分析了小麦纤维素相关基因突变体(ZC5和ZC7,为郑麦9023经EMS诱导的脆杆小麦)及其野生型(小麦品种郑麦9023)在三种磷素水平下(0、105、210 kg·hm~(-2))、不同发育时期的相关生理指标和成熟期农艺和品质性状。结果表明，基因型、磷水平和基因型与磷水平互作均对旗叶叶面积、旗叶SPAD值和籽粒淀粉含量有一定影响，影响程度因生育时期而异。不同处理小麦灌浆过程符合Logistic生长规律，籽粒干物质积累均呈“慢-Barasertib核磁快-慢”的变化趋势。基因型和磷水平均对成熟期籽粒蛋白质含量和全磷含量有极显著影响；基因型对成熟期株高、有效小穗数、穗粒数及千粒重有极显著影响。相关分析表明，籽粒渐增期灌浆速率和干物质积累量、快增期Infected fluid collections干物质积累量和旗叶SPAD值均与千粒重呈极显著正VE-822溶解度相关，籽粒渐增期、快增期持续时间和淀粉含量均与千粒重呈显著正相关。ZC5为磷敏感材料，施磷能提前ZC5最大灌浆速率出现日期，提高其最大灌浆速率和平均灌浆速率，且随着施磷量的增加籽粒蛋白质和全磷含量增加。纤维素合成相关基因突变对旗叶SPAD值、叶面积、籽粒淀粉含量、蛋白质含量、全磷含量、株高、有效小穗数、穗粒数和千粒重均存在显著影响。通过化学诱变改良小麦细胞壁成分可为小麦育种提供丰富的遗传资源。

小麦白粉病由活体营养专性寄生真菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)侵染引起,是目前影响小麦产量和品质的最严重病害之一。培育和种植抗白粉病小麦新品种,是目前公认的防治小麦白粉病最经济、有效、环保的方法。西尔斯山羊草(Aegiselleck Pevonedistatlops searsii Feldman&Kislev ex Hammer,2n=2x=14,S~sS~s)是小麦族山羊草属二倍体物种,是小麦育种改良中重要的基因来源。课题组前期研究发现和正式命名了来源于西尔斯山羊草的广谱高抗白粉病新基因Pm57,并利用携Pm57基因的小麦-西尔斯山羊草易位系材料,通过转录组测序,开发染色体特异分子标记。通过诱导部分同源染色体高频重组的中国春ph1b缺失突变体(TA3809)杂交,构建了F_2分离群体。结合分子标记与白粉病抗性将Pm57初定位在X67593和X62492两个分子标记之间,对应中国春参考基因组物理距离为5.13 Mb。在此基础上开展进一步研究,主要研究结果如下:1.对初定位中筛选到的重组体自交后代进行新一轮重组单株筛选,从其中两个杂合基因型衍生的2480个自交后代获悉更多单株中鉴定到82个在分子标记X67593和X62492之间发生交换的重组单株。同时,利用最新公布的西尔斯山羊草基因组序列,在定位区间内开发了16对2S~s染色体特异分子标记。利用这16对分子标记,将82个单株分为6种重组基因型(类型I-VI)。结合白粉病抗性鉴定,将Pm57基因精细定位在分子标记L10和L13之间,两个分子标记在西尔斯山羊草2S~s染色体上的物理距离为0.71 Mb。定位区间内注释编码基因为12个,其中抗病相关基因有2个(G4和G5),都具有串联激酶结构域。2.对前期EMS诱变获得的突变体进Antioxidant and immune response行筛选,鉴定出14个独立的Pm57抗性丧失突变体。对其中5个突变体及野生型进行了RNA-Seq测序分析(Mut RNA-Seq)。结果发现在精细定位区间内注释的12个基因中,3个基因(G1、G3和G12)为不表达基因,1个基因(G4)在3个感病突变体中存在错义突变,其余8个基因(G2、G5、G6、G7、G8、G9、G10和G11)在感病突变体中无突变。因此G4最有可能为候选基因。3.利用上述14个感病突变体对候选基因G4和G5进行PCR扩增和测序分析,发现G4在8个突变体发生了错义突变(Mut223:G78D,G903D;Mut141:G177E;Mut51:G193R;Mut209:D209N;Mut121:P747L;Mut268:R829W),在一个突变体中发生剪接位点突变(Mut17:G6587A)。而G5在14个感病突变体中未发生突变。突变体分析初步证明G4是抗小麦白粉病基因Pm57。4.对候选基因G4进行克隆,发现G4基因组全长9473 bp,存在7种可变剪接体(IF1-IF7),全长编码序列为3489 bp,有14个外显子,其编码1162个氨基酸,包含2个激酶结构域和1个v WA结构域。5.将G4基因全长编码序列(IF1)构建表达载体,遗传转化高感白粉病小麦品种Fielder,共获得33个阳性株系,其中2个阳性株系无表达。对T_0代和T_1代转基因植株进行白粉病抗性鉴定,发现除2个无表达株系外,其他所有阳性植株均高抗白粉病。转基因结果表明G4是Pm57基因。6.表达模式分析发现Pm57受白粉病诱导后上调表达,在12 h达到峰值。组织特异性表达分析发现Pm57在小麦叶中表达较高。利用挑单克隆测序的方法对G4存在的7种可变剪接体(IF1-IF7)进行表达分析,发现在未接白粉病时(0 hpi)可变剪接全长IF1占比50.6%,但在24 hpi时IF1占比提高至80.9%。而IF2~IF7丰度较低。亚细胞定位分析表明Pm57在细胞核和细胞质都有存在。共线性分析发现Pm57所在染色体区段在已发表的小麦族基因组中具有很好的共线性。然而,仅在二角山羊草(TB01)、高大山羊草(TL05),拟斯卑尔托山羊草(TS01)和野生二粒小麦(WEWSeq v1)基因组中发现Pm57的同源基因,在其他比对的参考基因组中缺失。7.利用携带Pm57的易位系的中国春-西尔斯山羊草易位系89(5)69和Pm57转基因系进行白粉菌分小种鉴定,发现Pm57对所测试的29个白粉菌生理小种均高抗或免疫,且Pm57转基因系表现出全生育期抗性。DAB和台盼蓝染色结果表明Pm57通过H2O2积累和宿主细胞死亡抑制孢子萌发参与病原体的防御反应。对下游PR基因(PR1、PR2、PR3、PR4和PR9)进行表达分析,发现89(5)69中PR基因的表达比对照中国春显著上调,且峰值(24 h)较Pm57晚。8.开发了Pm57-GFL-4F/4R、Pm57-GFL-5F/5R和Pm57-GFL-6F/6R三对Pm57诊断型分子标记,可有效用于分子标记辅助选育抗病品种。

目的:探究我国不同厂家静注人免疫球蛋白（IVIG)对阿尔茨海默症(AD)干预效果及与其成分及功能的关联性。方法:1)对IVIG治疗AD患者的临床试验进行meta分析。通过PubMed、Embase、Cochrane library、ClinicalTrials.gov、中国知网和万方数据库,检索截至2021年12月6日发表的所有的IVIG治疗AD的中英文文献。对检IACS-010759小鼠索到的文献筛选后进行meta分析。2)探索我国不同厂家IVIG对AD的干预效果。选择3月龄3xTg-AD和C57BL/6小鼠,随机分为5组:IVIG试验组(3xTg-AD+IVIG-A/B/C)、试验对照组(3xTg-AD+生理盐水)、空白对照组(C57BL/6+生理盐水)。注射剂量1g/kg,1周2次,连续给药12周后,再经过12周正常饲养进行后续试验。认知行为学实验检测小鼠学习和记忆能力;免疫组化分析小鼠海马病理;蛋白质组学、Luminex和平行反应监测(PRM)鉴定及验证海马中差异表达蛋白。3)IVIG中AD相关抗体的分析。ELISA法检测IVIG中Aβ42、tau抗体含量和p-tau抗体比率。4)评估我国不同厂家IVIG的抗炎效果。选取7月龄Balb/c雄性小鼠,随机分为5组:IVIG注射组(Balb/c+IVIG-A/B/C+LPS)、炎症对照组(Balb/c+生理盐水)、炎症模型组(Balb/c+LPS)。IVIG注射组预防性腹腔注射IVIG 1g/kg,炎症对照组/模型组分别给予等量生理盐水,连续7日,每日1次。最后给药1h后,IVIG注射组和炎症模型组腹腔注射LPS(1 mg/kg)。次日处死小鼠,进行血液分析和组织病理检测。结果:1)文献检索筛选后共纳入5个IVIG治疗AD的随机对照临床试验,涉及777名AD患者。IVIG组与安慰剂组相比,在Awww.selleck.cn/products/fg-4592DAS-cog评分指标上无明显差异;在ADCS-ADL和NPI评分指标上有明显改善(P=0.01);在全因停药率和不良事件发生率评分指标上无明显差异。2)与试验对照组相比,行为学实验中3个IVIG试验组旷场实验中总移动距离增加(P<0.05),但仅IVIG-C组在巴恩斯迷宫实验中目标象限停留时间和新物体识别实验中物体识别指数增加(P<0.05)。免疫组化检测发现仅IVIG-C组小鼠海马中Aβ沉积,tau磷酸化及海马中小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活均受到明显抑制(P<0.05);luhigh-biomass economic plantsminex检测表明仅IVIG-A和IVIG-C试验组小鼠大脑炎性因子的水平显著降低(P<0.05)。蛋白质组学提示IVIG-C组差异蛋白及互相作用主要富集在免疫反应及抗原加工和呈递过程。PRM进一步确认IVIG-C试验组差异蛋白主要富集在MHC I分子途径上。3)IVIG-A/B/C中Aβ42单体抗体浓度分别为1.8 ±0.1、3.5±0.3 和 28.0±0.3μg/mL,Aβ42 寡聚体抗体浓度分别为 2.3±0.1、7.9±0.3 和 49.4±1.9μg/mL,tau 抗体浓度分别为 2.3±0.6、6.4±0.9、33.3±3.6μg/mL,p-tau抗体比率分别为2.5、1.1、1.4。4)与炎症模型组相比,IVIG-A及IVIG-B注射组小鼠血清IL-6和TNF-α(P<0.05)水平明显降低;IVIG-C注射组小鼠血液白细胞计数、血清IL-6和TNF-α(P<0.05)水平明显降低,肝脏和肾脏炎症性损伤明显改善,H-score指数显著降低(P<0.05),大脑及海马区小胶质细胞及星形胶质细胞(P<0.05)过度激活数目明显减少。结论:全球IVIG治疗AD临床试验均由欧美国家开展,整体上对AD患者疗效受限,但在某些临床试验中IVIG表现出较好的认知改善效果。我国不同厂家IVIG对3xTg-AD小鼠疗效明显不同,其疗效可能与IVIG中AD相关抗体水平及抗炎能力成正相关。IVIG-C具有治疗AD的潜力,不仅改善了 3xTg-AD小鼠的认知行为能力,也减轻了小鼠大脑AD相关病理,抑制了神经炎症,这可能与海马中MHCI类分子的抗原加工和呈递途径的抑制有关。

布鲁氏菌病是一种常见的慢性人畜共患病,由布鲁氏菌侵入机体引起,对公共卫生和畜牧业造成巨大危害。布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,IV型分泌系统(Type IV secretion systems,T4SS)作为其重要毒力因子,可以至少分泌15种效应蛋白来发挥作用。效应蛋白作用于宿主细胞内的重要信号通路,抑制宿主先天免疫应答,促进布鲁氏菌在细胞内的存活与繁殖,引起慢性持续感染。有研究报道,T4SS分泌的效应蛋白BspF调控宿主分泌运输,加速布鲁氏菌的胞内复制。BspF具有一个GNAT(GCN5-Related N-Acetyltransferases)家族的乙酰转移酶结构域,猜测其可能具有巴豆酰转移酶活性。课题组前期通过体外酶活实验对BspF的酶活性进行验证,证实BspF在体外具有乙酰转移酶活性和去巴豆酰转移酶活性;通过巴豆酰化修饰组学分析发现BspF能够改变细胞内1525个不同蛋白上的5559个巴豆酰化位点的修饰,并发现p53蛋白在BspF的影响下巴豆酰化修饰减弱。p53作为一个转录因子可以调节下游基因的表达,促进细胞凋亡。因此猜测布鲁氏菌可能通过翻译后修饰宿主细胞蛋白来干扰宿主细胞的凋亡途径,避免病原体被nocardia infections机体的免疫系统清除,从而促进布鲁氏菌的胞内生存,并造成持续性感染。本文主要研究效应蛋白BspF对p53凋亡途径的影响以及BspF在布鲁氏菌感染过程中对细胞凋亡的影响。在本研究中,为了探索BspF调节细胞凋亡的具体机制,首先通过免疫共沉淀验证出BspF可以减弱p53巴豆酰化修饰,并鉴定出效应蛋白BspF与p53蛋白发生相互作用。随后将BspF影响p53的巴豆酰化位点进行突变使其丧失发生巴豆酰化修饰的功能,构建p53K351A突变体并验证了BspF可以特异性地去除p53K351的巴豆酰化修饰。进一步验证了BspF通过降低p53K351位点的巴豆酰化修饰,从而影响p53整体的巴豆酰化修饰水平。并且通过转染BspFΔGNAT(GNAT结构域缺失)重组质粒,以说明BspF对p53的去巴豆酰化修饰作用依赖于GNAT乙酰化转移酶结构域。此外,还发现在细胞内过量表达BspF会降低p53蛋白的表达水平,通过Western blot实验进一步研究发现BspF通过影响p53 K351位巴豆酰化修饰影响其表达量且依赖于GNAT结构域。布鲁氏菌S2308野生株和2308ΔbspF缺失株感染细胞后,通过Western blot实验以及荧光定量PCR实验检测线粒体凋亡相关因子Bax、AIF、p53、Caspase-3的蛋白表达和mRNA转录水平,发现与S2308野生株相比,ΔbspF缺失株促进这些凋亡因子的蛋白表达和mRNA转录。随后利用Western blot实验以及荧光定量PCR实验检测BspF在细胞内过量表达对这些凋亡相关因子的蛋白表达和mRNA转录水平的影响,发现效应蛋白BspF抑制这些凋亡因子在细胞内的表达和转录并依赖其GNAT结构域。流式细胞术selleck合成结果显示,Belnacasan体内ΔbspF缺失株感染后的细胞凋亡率与野生型S2308株相比更高。ΔbspF缺失株在细胞内生存能力比S2308野生株更弱。综上所述,效应蛋白BspF通过特异性地去除p53K351巴豆酰化修饰以降低其在细胞中的表达量,从而减少凋亡相关因子的mRNA转录和蛋白表达,抑制宿主细胞凋亡。本研究发现了布鲁氏菌对凋亡通路调控起到关键作用的效应蛋白,并且创新地引入巴豆酰化修饰这一重要的蛋白质翻译后修饰,为阐明布鲁氏菌通过分泌效应蛋白调控宿主细胞凋亡实现促进增殖提供了全新的机制。

玉米(Zea mays L.)是全球最重要的粮食作物之一,病原菌引起的玉米病害直接影响玉米生产,导致巨大的经济损失。在长期的进化过程中,植物形成了多种防御机制来抵抗病原菌的侵染。JA(JasmoPevonedistat溶解度nic Acid,茉莉酸)信号通路的核心原件转录因子MYC2在植物抗病领域发挥重要作用。本实验室前期获得了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMYC2在玉米中的同源基因ZmMYC7(Zm00001d030028)。本研究通过对突变体的抗病性分析和抗病相关基因ZmPRs表达量的检测,明确了 ZmMYC7在玉米抵抗真菌病害中的功能;通过Co-IP(Co-Immunoprecipitation,免疫共沉淀)、EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assays,凝胶阻滞试验)、dual-LUC(dual-Luciferase Reporter Assay,双荧光素酶报告试验)分析,探究了 ZmMYC7与ZmJAZs的互作关系,以及ZmMYC7-ZmJAZs复合体对ZmERF147的调控作用;通过生信分析、亚细胞定位分PD-0332991析、突变体抗病性分析等,证实了 ZmERF147的抗病功能;通过启动子分析、Y1H(Yeast one hybrid,酵母单杂交试验)分析,初步确定了 ZmERF147的下游靶基因。本研究为阐明ZmMYC7-ZmJAZs复合体调控ZmERF147影响玉米抵抗病菌侵染的分子机制,以及培育玉米抗病新品种奠定了基础。主要研究结果如下:1.生物信息学分析显示玉米ZmMYC7氨基酸序列与高粱(Sorghum bicolor)SbMYC2相似度最高,在进化上具有高度保守性,RNA-seq数据显示禾谷镰孢(Fusarium graminearum)侵染后,ZmMYC7表达量显著上调;获得了 ZmMYC7转座子插入突变体myc7-m1,并鉴定其为纯合子;抗病性分析表明,与自交系B73相比,ZmMYC7转座子插入突变体myc7-m1对玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularialunata)、玉米小斑病菌(Cochliobolus heter)ostrophus、玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)、禾谷镰孢更敏感;qRT-PCR(quantitative Real-Time PCR)检测显示,ZmMYC7 突变后,抗病相关基因ZmPRs表达量显著下调。以上结果说Hepatic differentiation明ZmMYC7正调控玉米的抗病功能。2.启动子元件分析发现ZmERF147(Zm00001d043205)启动子包含ZmMYC7结合的关键基序G-box,且ZmMYC7突变后,ZmERF147的表达量显著下调;EMSA、dual-LUC试验证实了 ZmMYC7对ZmERF147具有调控作用;Co-IP试验发现ZmJAZ11(Zm00001d005813)、ZmJAZ12(Zm00001d006860)与 ZmMYC7 存在互作关系;dual-LUC试验发现ZmMYC7与ZmJAZ1 1、ZmJAZ12结合会抑制ZmMYC7对ZmERF147的激活作用。以上结果说明ZmMYC7-ZmJAZs复合体影响ZmMYC7对ZmERF147的调控作用。3.生物信息学分析显示ZmERF1 47氨基酸序列与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)BdERF8相似度最高,在进化上具有高度保守性,RNA-seq数据显示禾谷镰孢侵染后,ZmMYC7表达量显著上调;亚细胞定位分析显示ZmERF147定位于细胞核;获得了ZmERF147转座子插入突变体erf147-m1,并鉴定其为纯合子;erf147-m1对玉米弯孢霉叶斑病菌、玉米小斑病菌、玉米圆斑病菌、禾谷镰孢的敏感性显著高于B73;erf147-m1中抗病相关基因ZmPRs表达量显著下调。以上结果说明ZmERF147正调控玉米抗病功能。4.启动子元件分析发现防御相关基因ZmDEF2(Zm00001d024302)启动子包含ZmERF147结合的关键基序GCC-box;ZmMYC7、ZmERF147突变后ZmDEF2的表达量显著下调;Y1H试验发现ZmERF147和ZmDEF2启动子在酵母中存在相互作用。以上结果初步证实了ZmDEF2是ZmERF147的下游靶基因。