ALK抑制剂

背景:胃腺癌(GC)是五种最常见的癌症之一,也是癌症相关死亡的第三大最常见原因,每年在全球造成近800,000人死亡。胃癌的治疗方式一般以手术为主(Dchronobiological changes2和腹腔镜切除术),虽然近年来取得了一些进展,但是结果仍不令人满意,晚期胃癌患者术后的5年生存率仍不足50%。针对参与免疫调节途径的免疫检查点抑制剂(ICIs)有助于打破免疫耐受循环,从而增加免疫细胞对癌症的免疫应答并抑制癌细胞诱导的免疫逃逸。代谢重编程在肿瘤细胞中的作用与支持肿瘤中不同关键细胞过程的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)水平密切相关。以往的研究表明,靶向GC细胞中的NAD+合成可以有效抑制能量和代谢产物的产生。目的:在本次研究中,我们聚焦在NAD+代谢相关基因(NMRGs)在胃癌中可能发挥的作用,为寻找NAD+代谢相关的治疗提供帮助。研究方法:1.数据下载和细胞获取:从TCGA在线数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载完整的基因表达数据、临床信息和突变数据(包括375个GC样本和32个正常胃组织样本)。此外,还下载了来自Gene Expression Omnibus(GEO,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/database)在线数据库的GSE84437数据集,共有433个GC样本测序数据。GSE163558单细胞数据集包括6例患者的原发性胃癌组织和6例不同器官或组织(肝、腹膜、卵巢、淋巴结)的转移癌组织,共计96810个细胞。从中国医学科学院细胞培GSK1349572小鼠养中心获得了人胃粘膜上皮细胞GES-1和五种胃癌细胞系(N87、SGC7901、MKN45、AGS、MGC803)。2.一致性聚类和基因集变异分析(GSVA):基于筛选出的NMRGs,使用“Consensus Cluster Plus”包对来自TCGA和GEO数据库的胃癌样本进行聚类分组。从分子特征数据库(MSig DB,https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)获得c2.cp.kegg.v7.4来执行GSVA。分别比较不同聚类样本间的患者临床信息,生存曲线和信号通路的差异。3.最小绝对收缩和选择算子(LASSO)回归分析:使用LASSO回归分析,我们构建了基于NMRGs的预后模型。在该模型下,探索了风险评分与肿瘤组织免疫细胞浸润、基因突变和肿瘤干细胞评分之间的关联。4.单细胞测序数据分析:对胃癌单细胞数据进行质控,剔除低质量细胞后,对构建预后模型的关键基因在细胞中的表达模型进行验证。5.通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术,在人胃粘膜上皮细胞GES-1和五种胃癌细胞系(N87、SGC7901、MKN45、AGS、MGC803)中,对构建预后模型的关键基因在细胞中的表达水平进行对比。结果:1获悉更多.我们基于33个NMRGs将808个GC样本聚类成3个簇。不同样本簇间的生存分析显示,来自具有较低NMRGs表达的集群的GC患者具有更好的生存时间(P=0.017)。高NMRGs表达组中,糖胺聚糖生物合成硫酸软骨素、ECM受体相互作用和粘着斑信号通路的富集显著高于NMRGs低表达组(P<0.05)。2.LASSO回归分析筛选并构建了由SGCE、APOD和PPP1R14A组成的预后模型。低风险组GC患者的总生存期(OS)优于高危组,风险评分、年龄和N分期对GC患者的预后很有价值。低风险组患者的免疫评分和基质评分低于高风险组患者。具体来说:滤泡辅助性T细胞和CD4记忆激活T细胞与三个关键基因的表达水平呈负相关,而CD4记忆静息T细胞、单核细胞和静息肥大细胞呈正相关。生存分析表明,SGCE、APOD和PPP1R14A的较低表达与患者的较好预后相关。3.风险评分与GC突变状态和微卫星不稳定性的相关性:低风险组的突变率高于高风险组,在前20个驱动突变基因中,TTN和TP53的突变率最高。高风险组的TMB评分低于低风险组,基于m RNA表达的干性评分与风险评分呈负相关。不同微卫星稳定性状态组的风险评分显著不同(P<0.05)。4.qRT-PCR验证SGCE、APOD和PPP1R14A的表达量:GC细胞系中SGCE、APOD和PPP1R14A的表达水平较正常人胃黏膜上皮细胞系明显增加(P<0.05)。5.胃癌单细胞数据的分析:SGCE、APOD和PPP1R14A与CAFs经典标志物在细胞中的表达高度一致(用于鉴定的CAFs标志物为ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、PDPN、THY1和COL1A1)。我们通过CAFs标志物对转录组样本进行量化和评分,以验证SGCE、APOD和PPP1R14A与CAFs之间的关系。结果显示,高风险组样本的CAFs得分较高,同样,相关性热图也显示它们具有非常明显的正相关性。最后,生存曲线的结果显示,CAFs较少的胃癌患者预后较好(P<0.001)。结合基因风险评分,发现CAFs较少且风险评分较低的患者预后最好(P<0.001)。结论:我们首次初步揭示了NMRGs与GC患者预后的相关性,并鉴定了与NMRGs协同作用的基因SGCE、APOD和PPP1R14A。NAD代谢可能通过SGCE、APOD和PPP1R14A调控CAFs,共同影响GC患者的预后、免疫细胞浸润和免疫治疗效果,这可能为免疫生物标志物和GC的潜在机制提供新的见解。

为开展河南省山药病毒种类及遗传变异的系统性研究，通过高通量测序（high-throughput sequencing）和RT-PCR检测疑似病毒病的山药样品188份，结果表明从山药样品中检测出5种病毒：日本山药花叶病毒(Japanese yam mosaic virus, JYMV)、油菜花叶病毒（youcai mosaiselleck抑制剂c virus,YoMV）、山药潜隐病毒（yam latent virus, YLV）、蚕豆萎蔫病毒-2(broad bean wilt virus 2, BBWV-2)和淮山药黄斑花叶病Canagliflozin核磁毒（yam yellow spot mosaicvirus,YYSMV）。JYMV、YoMV、YYSMV、BBWV-2和YLV的检出率分别为94.15%、87.23%、68.09%、42.02%和29.79%，其中98.94%的山药样品都存在复合侵染现象。本研究统计188份样品中共有20种复合侵染类型，其中JYMV+YYSMV+YoMV是主要复合侵染类型，检出率是26.60%。序列分析结果表明，YoMV和JYMV较保守，其次是YYSMV,secondary infectionYLV和BBWV2变异较大，遗传进化树分析结果表明本研究获得的分离物与同一地区的分离物亲缘关系较近。同时HTS分析结果表明在山药上检测到其他未明确分类地位的病毒种类，因此后续还需全面系统地对河南省山药病毒的种类开展研究。

目的：采用统计实验方法优化培养条件，以增加链霉菌S-159抗真菌活性成分的产量。方法：首先采用PlackettBurman设计以评估11transpedicular core needle biopsy个培养条件（包括2个虚拟变量）的显著性，发现大豆粉添加量、葡萄糖添加量、发酵时间和初始p H值为影响抗真菌活性的最显著因素。接下来通过最速上升路径分析确定进一步优化的中心点，并使用响应面法（RSM）中的中心复合设计（CCD）PUN30119体外进一步优化获得的4个显著因素。结果：实验结果符合二阶多项式模型，其确定系数（R2）为0.986，调整后的确定系数（Adj R2）为0.974。求解方BMS-907351程得到优化组合条件为大豆粉添加量23.53 g/L、葡萄糖添加量17.04 g/L、发酵时间60.20 h和初始pH值7.61，抗真菌活性实测值为410.5 U/mL，与该模型预测的413.6 U/mL基本一致，优化后链霉菌S-159代谢产物的抗真菌活性提高了1.7倍。结论：统计实验方法可用于链霉菌S-159的发酵培养条件优化，研究结果为链霉菌S-159的大范围应用提供了数据基础。

目的:本研究旨在设计、制备以及表征巨噬细胞靶向的姜黄素纳米药物,体外验证其通过激活AKT/STAT6通路重塑滑膜炎微环境的作用Nervous and immune system communication与机制。方法:(1)分步合成具有甘露糖靶向基团的聚合物材料Mannose-PEG-PCL以及无靶向聚合物材料PEG-PCL,通过核磁共振氢谱(~1H-NMR)、傅里叶红外光谱(FT-IR)证明化合物正确合成;(2)采用溶剂挥发法制备负载CUR的Mannose-PEG-PCL@CUR以及PEG-PCL@CUR载药纳米颗粒,透射电镜观察纳米颗粒形貌,体外考察药物释放;使用Live/dead染色以及CCK-8试剂盒评价空白胶束生物相容性以及载药胶束细胞毒性;通过激光共聚焦显微镜评价细胞对纳米颗粒细胞内吞情况;(3)采用Western blotting以及q PCR定量检测Mannose-PEG-PCL@CUR对巨噬细胞炎症因子分泌以及AKselleck PD0325901T/STAT6信号通路的影响。结果:(1)成功合成了PEG-PCL以及Mannose-PEG-PCL聚合物,并通过~1H-NMR以及FT-IR验证了产物结构。胶束颗粒直径100 nm左右,呈均一球形,CMC值13.2×10~(-3),载药率分别为7.43%和7.56%,72 h内体外药物累积释放量低于50%;(2)材料对RAW264.7巨噬细胞以及软骨细胞几乎无毒,纳米药物具有低细胞毒性。CLSM成像在4小时观察到胞内明显的靶向纳米药物绿色荧光;(3)Mannose-PEG-PCL能够增加AKT、p-AKT、STAT6、p-STAT6信号分子的表达,同时抑制IL-6基因表达,促进IL-10基因表达。结论:(1)聚合物PEG-PCL、Mannose-PEG-PCL成功合成,该化合物具有预期结构,并且具有良好的亲疏水比例,所制备的纳米颗粒呈球形,粒径分布均一;(2)胶束具良好的载药能力,在体外模拟环境中具有一定缓释效应,不会因外部p H改变而迅速崩解,能够发挥稳定的药物释放功能;(3)Mannose-PEG-PCL靶向纳米颗粒具有良好生物相容性,能够主动靶向巨噬细胞膜受体,增加巨噬细胞对纳米颗粒的内吞摄取;(4)Mannose-PEG-PCL@CUR载药胶束拥有较低细胞毒性,能够通过AKT/STAT6通路抑制促炎因子分泌,同时促CL13900临床试验进抗炎因子表达,发挥重塑炎症微环境的作用,具有抗OA潜力。

聚烯烃材料具有生产成本低、加工性能良好和综合性能优异等优点,因此被广泛应用于生活和生产等各个领域。而赋予聚烯烃材料独特优异性能的关键就在于催化剂的设计及合成。在众多催化剂类型中,茂金属催化剂在聚烯烃工业生产中占有着不可代替的地位。本论文基endocrine-immune related adverse events于茂金属催化剂具有催化活性高、选择性好以及聚合物结构可控等优点,设计并合成了一种基于蒽骨架的酚氧基单茂钛双金属催化剂Ti2,并对合成的蒽骨架酚氧基配体以及该配体的钛金属配合物进行了表征以及结构分析,对其进行了催化性能的研究,期望能制备具有优异性能的聚烯烃材料。本论文主要工作总结如下:设计并合成了一种基于蒽骨架的酚氧基单茂钛双金属催化剂,并对其进行了表征,通过对X射线单晶衍射结果进行分析,证明了该配合物为C_2对称结构,两金属原子之间距离为7.433?。探究了Ti2催化烯烃聚合的性能,聚合结果表明:在以四五氟苯基硼酸盐([Ph_3C][B(C_6F_5)_4])作为助催化剂的情况下,Ti2具备一定的耐高温性能以及优异的共聚性能,在确认细节聚合温度为120?C、乙烯压力为5 atm时,乙烯均聚活性可达到62400 kg(PE)·mol~(-1)(Ti)·h~(-1);在聚合温度为120?C、乙烯压力为3 MPa、1-辛烯浓度为2.5 M时,Ti2催化乙烯与辛烯共聚活性高达112800 kg(PE)·mol~(-1)(Ti)·h~(-1),将聚合温度从120?C升高到160?C时聚合活性虽然有所降低,但聚合活性仍可达到82800 kg(PE)·mol~(-1)(Ti)·h~(-1)。使用Ti2催化乙烯与降冰片烯共聚时,聚合效果更加优异,Ti2与其单核类似物Cp’Ti(O-2,6-~iPr_2C_6H_3)Me_2(Ti1)相比,在活性、共聚单体插入率和聚合物分子量方面都具有明显的优势:在降冰片烯浓度为4 M、乙烯压力为1 atm的条件下,Ti2催化乙烯与降冰片LGX818烯进行共聚时,生产的共聚物中降冰片烯单体的插入率高达48.7 mol%,聚合物分子量可达到1650 kg?mol~(-1),而在相同条件下Ti1甚至没有活性。

购买BI 10773目的 探讨猫爪草(RTR)醇类提取物对于小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)极化的影响。方法 提取6～8周BALB/c雌鼠骨髓细胞，用DMEM完全培养基(含有20 ng/mL GM-CSF)培养7 d诱导为BMDM。用CCK8摸索RTR刺激巨噬细胞的最适浓度，并观察巨噬细胞的形态变化。ELISA检测细胞培养液中iNOS、TGF-β、TNF-α、IL-10的变化；qRT-PCR检测细胞内的IL-6、TNF-α、iNOS、TGF-β、IL-10、Arg-1的表达；FCM检测细胞表面标志物NOS2和CD206的表达。结果 RTR刺激BMDM的最佳浓度为100μg/mL,刺激24 h后呈梭形改变。RTR处理组与对照组相比，TNF-α和iNOS分泌水平升高，TNF-α、iNOselleckchem LapatinibS和ILPDCD4 (programmed cell death4)-6的mRNA表达水平升高(P<0.05);TGF-β和IL-10分泌水平降低，TGF-β、IL-10和Arg-1的mRNA表达水平降低(P<0.05);刺激36 h后，巨噬细胞表面高表达NOS2,CD206低表达(P<0.05)。结论 猫爪草醇类提取物可刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞产生M1型极化。

铂类抗癌药物一直作为临床上主要的化疗试剂,但因其本身的性质所决定,铂类抗癌药物的毒副作用很明显,且容易产生耐药性,以上缺陷限制了其在临床上的长期使用。目前其他类型的金属基抗癌化合物已经取得了一定的进展,大量的研究表明钌和铼配合物有着独特的抗癌机制,与铂类抗癌药的靶点不一致,从而规避了耐药性,并且它们的抗肿瘤活性部分超过顺铂。钌基抗癌化合物目前已经进入了临床实验,如NAMI-A,KP1019等,它们展现出不同于铂类抗癌药物的抗癌活性,为癌症的治疗提供了新的有效途径。研究表明,顺铂耐药性的一个重要原因是其靶向作用于细胞核DNA,因此寻找DNA以外的靶标是必要的。JMJD(含有Jumonji结构域的赖氨酸去甲基化酶)在肿瘤组织中过表达,其主要功能为催化组蛋白的去甲基化,从而促进癌症相关基因的转录表达,进而促进癌细胞的增殖、转移、血管生确认细节成以及药物耐药性的产生。因此,目前抗肿瘤药物研究的热点之一是开发具有JMJD去甲基化酶抑制活性的药物。金属配合物与小分子的结合因其可调控的三维构型而被广泛用于各种酶抑制剂的研发,这种构型可以提高与酶结合的亲和力和选择性,提高与蛋白质残基共价作用的能力,最终达到多重抗肿瘤作用模式。另外,主要功能为调节植物生长的丁酰肼,近年来被发现还具有一定的JMJD抑制活性,从而能够抑制癌细胞的生长。这为寻找疗效更好、毒副作用更小的抗癌药物提供了有效途径。基于以上研究背景,本论文设计合成了一系列与丁酰肼键合的铼(Ⅰ)或钌(Ⅱ)配合物,并且探究其抗肿瘤活性及作用机制。本论文包括以下三章:第一章:主要介绍钌(Ⅱ)和铼(Ⅰ)配合物及其Drug response biomarker研究进展。同时介绍组蛋白去甲基化酶的研究进展以及凋亡相关的进展。第二章:设计合成了2个铼(Ⅰ)配合物,Re-1和Re-2。研究表明,配合物Re-2主要定位于线粒体造成一系列的线粒体损伤相关事件。同时,Re-2进一步抑制JMJD活性,诱导细胞周期阻滞在G2/M期以及抑制细胞迁移和菌落的形成。我们的研究表明,这些铼(Ⅰ)配合物是具有双重功能的(包括JMJD抑制和线粒体介导的细胞凋亡)有前途的抗癌剂。第三章:设计合成了2个金属钌(Ⅱ)配合物Ru-1和Ru-2。获悉更多MTT实验数据显示,Ru-2对肿瘤细胞有明显的抑制作用,且与临床化疗药物顺铂相比,Ru-2对测试的肿瘤细胞系显示出更高的细胞毒性。进一步作用机制研究表明,Ru-2抑制JMJD的活性,诱导肿瘤细胞凋亡,包括以下几个关键性事件:增加细胞内活性氧水平,降低线粒体膜电位,并能抑制肿瘤细胞迁移和菌落形成。

目的 探究孤独症谱系障碍(ASD)中发现的更多转录因子EB(TFEB)基因3种变异对神经元轴突发育的影响及其机制。方法 构建与ASD相关的3个TFEB突变体质粒和TFEB shRNA干扰质粒，细胞转染上述质粒后通过免疫荧光、细胞核质分离及蛋白免疫印迹检测TFEB变异是否改变其亚细胞定位；利用核糖体抑制剂CHX处理后经蛋白免疫印迹检测TFEB变异对其蛋白稳定性的影响；进行原代小鼠神经元培养并转染上述质粒，通过免疫荧光检测TFEB变异对神经元轴突生长发育的影响；使用实时定量PCR检测TFEB下游自噬-溶酶体基因的表达水平，以荧光素酶报告基因法测量TFEB的转录活性。结果 ASD相关突变体p.R22Q及p.R465W导致TFEB在细胞核的定位增加，但变异并不改变蛋白的稳定性。同时，野生型(WT)TFEB的过表达可增加神经元轴突长度，而ASD相关的TFEB突变体则不能。这表明这些突变导致TFEB促进神经元轴突生长的功能受损。同时，自噬激活剂寻找更多Rapamycin可恢复由TFEB干扰引起的神经元轴突缩短。TChronic hepatitisFEB WT的过表达增加了下游自噬-溶酶体相关靶基因(LAMP1、SQSTM1、CTSB、CTSD、CTSF、MAPLC3)的表达，但ASD相关的TFEB突变体降低了对相关靶基因的调节能力。结论 TFEB变异可能导致自噬-溶酶体功能受损和神经元发育异常，为ASD发病机制和潜在治疗靶点提供了新的见解。

玉米是我国第一大粮食作物,也是最早利用杂种优势的作物之一。雄性不育作为一种遗传工具,不但能节约传统人工去雄的成本,而且可以保证玉米杂交种子的纯度与质量,提高种子生Imidazole ketone erastin产效率。因此,挖掘雄性不育基因,在玉米杂交种生产上具有重要的理论和实践意义。本研究以自然突变获得的雄性不育姊妹交群体Ky335MS为材料,通过形态学比较和细胞学观察,结合经典遗传学及分子生物学方法,鉴定突变体Ky335ms的败育特征和遗传方式,并对不育基因进行初定位,为后续精细定位和候选基因克隆奠定基础。主要结果如下:1、表型观察结果:通过雄性不育突变体Ky335ms表型观察,发现突变体Ky335ms营养生长与姊妹交群体中可育株Ky335F的表型无差异。但是,该突变体的花药体积变小且颜色为浅黄色;在花药发育后期,花药干瘪皱缩,不能正常散粉。通过花药淀粉I_2-KI染色,发现突变体Ky335ms花药不能被染色,证明了该突变体花药腔内无成熟花粉粒产生。表明突变体Ky335ms败育彻底,为典型的“无花粉”型雄性不育。2、细胞学观察结果:1%醋酸洋红染色观察发现,突变体Ky335ms形成的四分体形态各异,细胞质不均等分裂;到小孢子时期,小孢子畸形,最终解体消失。花药进行半薄切片观察结果表明,突变体可以形成完整的四层花药药壁结构,小孢子也可以从四分体中释放出来,但在小孢子发育中后期,小孢子逐渐皱缩降解,绒毡层细胞退化异常,并逐渐液泡化。在成熟花粉粒阶段,花药壁坍塌,药室内无花粉粒。说明突变体Ky335ms的败育发生在小孢子时期。3、遗传分析结果:突变体Ky335ms在不同环境中均表现出不育表型,说明该突变体的不育性状能稳定遗传且不受环境影响;以姊妹交群体中可育株与不育株杂交,以及用该群体中的可育株进行自交,其后代表型分离比例分别符合1:1和3:1,可初步判定该突变体由隐形单基因所控制。以突变体Ky335ms与8个正常自交系为Laboratory biomarkers亲本,分别构建正反交群体和回交群体,其中F_1代全部表现为可育,F_2代和BC_1代的育性分离比例分别符合3:1和1:1。综上表明,突变体Ky335ms的不育性状由单隐性细胞核基因控制。4、不育基因定位:以(Ky335ms×K115)F_2群体作为定位群体,通过SSR-BSA方法对GDC-0068试剂候选基因进行定位。首先利用双亲从567对SSR标记中共筛选出了179对具有多态性的标记;随后在F_2极端混池中筛选出5对具有多态性的标记。利用这5对标记对F_2群体中319个隐性不育单株进行基因分型并进行连锁分析。最终将候选不育基因ms335初步定位于9号染色体长臂上,位于SSR分子标记bnlg430与umc2339之间的1.27 c M范围内。本研究结果为后续精细定位和不育基因克隆奠定了基础。

目的 构建白细胞介素33(IL-33)基因重组的狂犬病病毒，明确表达IL-33对重组病毒体外表型特征的影响。方法从狂犬病强毒株感染SB431542配制的小鼠脑内扩增获得的IL-33基因，通过反向遗传操作技术Blebbistatin IC50插入亲本病毒LBNSE基因组的G、 L基因之间，并拯救过表达IAquatic microbiologyL-33的重组病毒；将重组狂犬病毒rLBNSE-IL33和亲本毒株LBNSE感染BSR仓鼠肾细胞或NA小鼠神经瘤细胞；在感染复数=0.01的情况下，测序和荧光抗体病毒中和试验检测重组病毒在传代过程中的稳定性；检测病毒滴度病灶形成单位(FFU)绘制多步生长曲线(感染复数=0.01);细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性；ELISA检测不同感染复数感染细胞上清中IL-33的含量。结果 拯救获得过表达IL-33的rLBNSE-IL33,rLBNSE-IL33能够稳定连续传代至少10代，且毒价约为10~8 FFU/mL; rLBNSE-IL33能够以剂量依赖的形式高水平表达IL-33,但检测被LBNSE感染的细胞上清，没有检测到IL-33的高表达；检查rLBNSE-IL33和亲本毒株LBNSE在BSR和NA细胞中5 d内的滴度，显示无明显差别，具有相似的生长动力学特性；过表达IL-33对感染细胞增殖及活性无显著影响。结论 IL-33基因重组和表达对狂犬病病毒体外表型特征无显著影响。