ALK抑制剂

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种具有高发病率和死亡率的破坏性脑部疾病。全球范围内,脑出血患者人数接近两千万人,占所有脑卒中患者的10-15%,波及范围巨大,年死亡率超过50%。近年来,发病人群呈现年轻化趋势。脑出血后的继发性脑损伤,会引起患者神经功能障碍,进而导致患者生活无法自理,加重患者家庭和社会负担。因此,有必要对脑出血及其继发性脑损伤展开深入的研究探索,为临床脑出血的治疗提供新的思路。脑出血发生后,血细胞进入脑实质,被分解成为铁离子、血红素和凝血酶等可诱发自由基产生的物质,导致神经损伤;这些Canagliflozin临床试验分解产物还能诱发炎症,募集免疫细胞清除血块或加剧炎症反应,进一步造成脑损伤。氧化应激在脑出血后的继发性脑损伤中起重要作用,这主要由于氧化应激在脑出血病理过程及其病理生理反应阶段皆发挥一定的作用。免疫细胞(巨噬细胞、中性粒细胞等)参与脑出血后的炎症反应,其中,巨噬细胞是在脑出血发生后,首先被募集的细胞之一。巨噬细胞通过不同的极化倾向,发挥促炎或者抑炎的作用。ITGB1(integrinbeta 1)是整合素家族的一员,在脑组织中具有广泛的表达。脑出血后,ITGB1会在脑组织中被高度表达,并在神经元凋亡、血管损伤、神经炎症反应和脑水肿发生中发挥重要作用;除此之外,ITGBI还与血脑屏障的破坏有关。另外,ITGB1对于调节血管的形成和稳定性、细胞粘附等方面发挥着关键作用。ITGB1对包括巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞具有重要的调控作用,并通过与其他蛋白结合来参与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等生理过程。在内皮细胞中,ITGB1作为细胞外基质和细胞内信号转导中的重要组分发挥着重要作用,并可对内皮细胞的粘附和生长等生物学功能发挥调控作用。阿托伐他汀是一种适用于心脑血管疾病(如冠心病)的他汀类药物,许多研究证明它能够抑制氧化应激、保护心血管功能、抑制炎症等。然而,在脑出血的治疗中,阿托伐他汀的作用是否确切仍存在争议。因此,本研究旨在通过体内、体外实验,证实阿托伐他汀在脑出血中的治疗作用,并阐明其可能的治疗机制:通过调控ITGB1抑制脑出血后内皮细胞凋亡、炎症反应、氧化应激及屏障功能损伤。本研究内容验证了阿托伐他汀在脑出血中的治疗价值,完善了脑出血后脑损伤及他汀干预有效的分子机制,为进一步可能的药物靶点的开发提供了基础和线索。第一部分:脑出血后动物ITGB1的表达特征、氧化应激、炎症反应水平的研究1)研究目的:本实验旨在探究大鼠脑出血后24h和72h的脑组织中炎性反应、氧化应激、血脑屏障功能及ITGB1表达水平的特征。2)研究方法:采用胶原酶VII法,建立SD大鼠脑出血模型,并在24 h和72 h时,收集脑组织和血清样本,采用H&E染色对脑组织病理情况进行观察,采用TUNEL染色对脑组织凋亡情况进行观察;采用伊文思蓝渗透法,并结合qRT-PCR方法检测MMP2、MMP9及Occludin和Claudin-5表达水平,评估动物血脑屏障功能;ELISA方法检测动物血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平,采用qRT-PCR和Western blot方法检测脑组织中ITGB1表达水平;根据试剂盒方法检测脑组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和 8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHdG)水平;3)研究结果:随着时间的推移,在脑出血模型组中,神经元损伤逐渐加剧,72h时达到最高水平,同时凋亡水平也随之增加。72h时,伊文思蓝渗透水平达到最高值,并伴随着Occludin、Claudin-5的表达水平下调和MMP2、MMP9的表达水平上调。在模型组中,炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平明显上调,尤以72h时表现最为明显。SOD水平在模型组中呈现下调趋势,同时伴随ITGB1表达的上调,MDA和8-OHdG水Nirogacestat体外平也呈现出上调趋势。4)小结:胶原酶VII成功诱导大鼠脑出血模型,该脑出血动物模型随时间推移,表现出氧化应激加剧、炎性因子增加、血脑屏障功能受损,并伴随着逐渐升高的ITGB1表达。因此,ITGB1的上调可能与脑出血后的继发性损伤存在相关性。第二部分:阿托伐他汀通过ITGB1干预脑微血管内皮细胞参与下的脑出血继发性脑损伤1)研究目的:本部分实验旨在研究阿托伐他汀是否通过调节ITGB1的表达来进一步影响脑微血管内皮细胞的屏障功能、凋亡程度、炎症反应和氧化应激。2)研究方法:a.通过培养脑微血管内皮细胞,并采用血红素(hemin)处理细胞,诱导脑出血体外模型。在使用阿托伐他汀处理后,检测内皮细胞中ITGB1的表达水平。随后,将内皮细胞与巨噬细胞共培养,并对内皮细胞的屏障功能、凋亡水平、炎症反应及氧化应激进行检测。b.设计并合成针对ITGB1的siRNA,并利用qRT-PCR和Western blot方法对siRNA的干扰效率进行检测。c.在基于Hemin诱导的脑出血体外模型中,使用siRNA对ITGB1进行表达干扰。之后将内皮细胞与巨噬细胞进行共培养,对内皮细胞的屏障功能、凋亡水平、炎性反应及氧化应激进行检测。d.在脑出血体外模型中,经过阿托伐他汀处理后,进行ITGB1过表达处理。然后将内皮细胞与巨噬细胞共培养,进一步分析内皮细胞的屏障功能、凋亡水平、炎性反应及氧化应激。3)研究结果:a.在经过血红素处理的内皮细胞中,ITGB1的表达显著升高;与此同时,在与巨噬细胞共培养之后,内皮细胞的屏障功能明显受损,伴随着炎症反应和氧化应激的加剧以及凋亡水平的提高。然而,在使用阿托伐他汀进行处理之后,内皮细胞的屏障功能改善,且炎症反应和氧化应激以及凋亡水平都得到了缓解,并且ITGB1的表达水平受到了抑制。b.在实验中,siRNA#2表现出最高的敲除效率。c.在血红素诱导的脑出血体外模型中,ITGB1 siRNA可以显著地抑制ITGB1的表达水平,同时能够逆转模型组细胞中内皮细胞屏障功能的损伤、过度的炎症反应和氧化应激,以及凋qPCR Assays亡水平的上升。d.在血红素诱导的模型组细胞中,ITGB1的过表达能够显著逆转阿托伐他汀对内皮细胞屏障功能的保护作用,并再次上调了内皮细胞的炎症反应、氧化应激和凋亡水平。4)小结:a.经血红素处理后,脑微血管内皮细胞产生在巨噬细胞参与下的细胞屏障功能受损,并伴随氧化应激、炎症反应和凋亡水平加剧;b.对内皮细胞中ITGB1进行敲降后,可对巨噬细胞参与下的内皮细胞屏障功能损伤、氧化应激和炎症反应过激、凋亡水平上调发挥抑制作用;c.阿托伐他汀主要通过调控ITGB1表达发挥对内皮细胞的保护作用。第三部分:阿托伐他汀通过调控ITGB1对脑出血血脑屏障损伤的保护机制1)研究目的:体内实验证实,阿托伐他汀通过调节ITGB1可以抑制脑组织内血脑屏障功能的损伤,并降低组织内氧化应激、凋亡水平和炎症反应。2)研究方法:采用胶原酶VII诱导大鼠动物模型,使用阿托伐他汀作为治疗药物,并利用腺相关病毒对动物脑组织ITGB1进行过表达;检测各组动物脑组织血脑屏障功能(伊文思蓝渗透情况、MMP2、MMP9、Occludin和Claudin-5表达水平)、炎症反应水平(IL-1β、IL-6和TNF-α)、氧化应激水平(SOD、MDA和8-OHdG)、凋亡水平;并采用免疫组化方法,检测动物脑组织中巨噬细胞(IBA1)、M1型巨噬细胞(CD86)、M2型巨噬细胞(CD163)的分布情况。3)研究结果:a.在模型组中,阿托伐他汀具有抑制ITGB1表达,下调脑组织氧化应激、炎症反应、血脑屏障损伤及细胞凋亡的作用,且对M1型、M2型巨噬细胞极化分别表现出抑制、促进作用;b.ITGB1过表达逆转了阿托伐他汀对氧化应激、炎症反应、血脑屏障损伤及细胞凋亡的抑制作用,并对M1型、M2型巨噬细胞极化分别表现出促进、抑制作用。4)小结:在脑出血动物模型中,阿托伐他汀具有通过调控ITGB1表达,抑制氧化应激、炎症反应、血脑屏障损伤和细胞凋亡的作用,并对M1型、M2型巨噬细胞极化分别表现出抑制、促进作用。结论:阿托伐他汀在脑出血模型中可通过调控ITGB1表达,抑制脑出血后组织中的氧化应激和炎症反应引发的继发性脑损伤,起到脑保护作用。

目的 探讨卡贝缩宫素联合传统缩宫素预防高危妊娠剖宫产产后出血及对产妇血浆纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体（D-D）、凝血酶时间（TT）、部分凝血活酶时间（APTT）的selleck合成影更多响，为临床治疗提供参考依据。方法 依据随机数字表法将昆山市中医医院2020年7月至2022年3月收治的行剖宫产的高危妊娠孕妇80例分为PPAR gamma hepatic stellate cell对照组（40例，胎儿娩出后进行宫体注射缩宫素）与观察组（40例，在对照组基础上静脉滴注卡贝缩宫素），静脉滴注至产后2 h，术后观察48 h。比较两组产妇术中及术后2、24 h出血量，产后24 h出血率，术前与术后24 h心率、血压，术前与术后48 h血红蛋白、血浆FIB、D-D、TT、APTT水平，以及子宫收缩良好率、治疗期间不良反应发生情况。结果 与对照组比，术中及术后2、24 h观察组产妇出血量均显著降低；产后24 h出血率显著低于对照组；术后48 h两组产妇血红蛋白水平均显著低于术前，而血浆FIB、D-D水平均显著高于术前，观察组产妇血红蛋白、血浆FIB、D-D水平显著高于对照组，TT、APTT均显著短于术前，观察组显著短于对照组；两组产妇子宫收缩良好率比较，观察组显著高于对照组（均P <0.05）。但两组产妇术前、术后24 h组内及组间心率、收缩压、舒张压及两组产妇治疗期间恶心、头痛、面部潮红、心动过速总发生率经比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 在传统缩宫素的基础上加用卡贝缩宫素可降低行剖宫产的高危妊娠产妇的出血量与出血率，增加子宫收缩频率，改善凝血功能，不会增加产妇心血管系统负荷，安全性良好。

白僵菌素(beauvericin,BEA)是一种新兴的真菌毒素,是由镰刀菌、球孢白僵菌等产毒真菌产生的次级代谢产物,广泛存在于各种大麦、小麦、大米、玉米和谷物制品中。有研究报道BEA具有强烈的肝毒性,肝脏是机体重要的代谢调控和解毒中心,因此有必要深入研究BEA肝毒性的具https://www.selleck.cn/products/ag-221-enasidenib.html体作用机制。活性氧(ROS)介导的氧化应激参与了 BEA诱导的细胞毒性,核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)是维持氧化还原稳态的重要核转录因子。研究显示氧化应激产生的ROS以及Nrf2信号通路均能影响自噬的发生。ROS-Nrf2信号通路介导的细胞自噬是否参与BEA诱导的肝细胞毒性损伤有待研究。本试验以BRL3A细胞(大鼠肝细胞系)为研究对象,探究了 BEA对细胞氧化应激、Nrf2信号通路的影响,以及ROS-Nrf2与自噬信号之间的关系在BEA诱导的肝细胞毒性损伤中的作用。1 BEA致BRL3A细胞氧化损伤为探究BEA对大鼠肝细胞毒性损伤的影响,本试验将不同浓度BEA(0、0.5、1、1.5、2、3和4μmol/L)作用于BRL3A细胞12 h,通过CCK-8法和LDH释放法检测细胞活率;倒置显微镜观察细胞形态变化以及透射电镜观察细胞超微结构改变;荧光显微镜和流式细胞术测量细胞内ROS和超氧化物阴离子水平,试剂盒检测氧化损伤相关指标。结果显示,随着BEA剂量增加,细胞活率下降,LDH释放增多,细胞呈现皱缩状态,最终选用0、1、1.5和2μmol/LBEA作用于BRL3A细胞12 h。透射电镜图像显示,BEA破坏细胞核和线粒体结构。此外,BEA显著升高细胞内ROS和MDA含量(P<0.05),超氧化物阴离子水平也升高;BEA剂量依赖性增高GSH-Px活性,而CAT、T-SOD活性和GSH含量呈现先上升后下降趋势。结果表明,BEA诱导细胞氧化应激,发生氧化性损伤,降低细胞活力。2 BEA致BRL3A细胞自噬为探究细胞自噬是否参与BEA诱导的BRL3A细胞毒性损伤,首先将不同浓度BEA(0、1、1.5和2μmol/L)作用于BRL3A细胞12h,采用qRT-PCR检测自噬相关基因转录;Western blot检测自噬相关蛋白表达;免疫荧光检测LC3聚点;透射电镜观察自噬小体生成;BEA分别联合自噬抑制剂CQ、促进剂RAPA以及ROS清除剂NAC探究其对细胞自噬的作用。结果显示,BEA显著激活自噬相关基因Beclin1、SQSTM1的转录(P<0.05);自噬标记蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG5的表达均显著升高(P<0.05);LC3呈点状聚集分布在细胞核周围;BEA促进自噬小体生成增多。BEA分别联合CQ和RAPA,与BEA单独组相比,BEA+CQ处理组LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG5和p62的表达水平显著下降(P<0.05),细胞活率上升;BEA与RAPA共处理组LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62和Beclin1蛋白的表达量明显升高(P<0.05),细胞活率降低,提示CQ和RAPA分别抑制或促进BEA诱导的细胞自噬。与单独BEA组相比,NAC与BESerratia symbioticaA共孵育后有效降低细胞内ROS水平,在此基础上检测NAC对细胞自噬的影响,发现与BEA组相比,加入NAC后显著抑制自噬相关蛋白的表达(P<0.05),LC3聚点数量也减少,呈弥散分布。以上结果表明,BEA诱导BRL3A细胞自噬发生,且这一过程是由ROS介导的。3 ROS-Nrf2通路在BEA致BRL3A细胞自噬中的作用为阐明ROS介导的氧化应激、Nrf2信号通路和自噬之间的关系在BEA诱导的肝细胞毒性损伤中的作用,首先探究了 BEA对BRL3A细胞Nrf2信号通路的影响,将不同浓度BEA(0、1、1.5和2μmol/L)处理细胞12 h,Western blot检测Nrf2信号通路相关蛋白表达变化,qRT-PCR检测Nrf2下游抗氧化基因的转录水平,免疫荧光监测Nrf2核转位,再联合NAC检测ROS在BEA诱导Nrf2信号通路变化中的作用;其次,BEA联合Nrf2抑制剂ML385和激活剂CDDO探究Nrf2信号通路对细胞自噬的影响。结果显示,不同浓度BEA显著降低Keap1表达量(P<0.05),促进NQO1和HO-1蛋白表达,细胞核内Nrf2蛋白表达升高,Nrf2入核明显。BEA联合NAC处理细胞,与单独BEA组相比,NAC显著抑制NQO1和核蛋白Nrf2的表达(P<0.05),HO-1表达也下降,Nrf2入核减少。上述结果表明BEA通过ROS介导激活Nrf2信号通路。BEA与ML385联合处理寻找更多后,与单独BEA组相比,细胞活力显著升高(P<0.05),减弱了 BEA对Nrf2信号通路的活化效应,降低自噬水平;然而,BEA联合CDDO处理后呈现相反趋势,表明BEA诱导的自噬激活是由Nrf2介导的。以上结果表明,ROS介导的Nrf2信号通路正向调节BEA诱导的细胞自噬,BEA通过ROS-Nrf2-自噬轴参与诱导肝细胞毒性损伤。结论:BEA诱导大鼠肝细胞氧化应激,引起氧化性损伤,ROS介导的氧化应激在BEA激活的细胞防御反应中起作用。BEA激活细胞Nrf2信号通路和自噬,且自噬激活是由ROS-Nrf2通路介导的,二者的激活进一步加剧BEA诱导的肝细胞毒性损伤。

目的:探讨宫颈上皮内瘤变患者血清鳞状细胞癌抗原(SCC)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、趋化素(Chemrin)的变化及其诊断学价值。方法:选取我院2019年4月至2022年4月经病理学检查确诊的101例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者作为CIN组、同期经病理学检查证实为早期宫颈癌患者50例作为宫颈癌组，对比两组患者实施治疗之前的血清SCC、M-CSF、Chemerin测定值，并根据CIN分期、高危人乳头状瘤病毒(HR-HPV)病毒载量检查结果进行分层对比分析，并对比CIN患者在手术前、手术后3个月血清SCC、M-CSF、Chemerin水平；采用受试者工作特征曲线(ROC)分析SCC、M-CSF、Chemerin在鉴别诊断CIN及早期宫颈癌中的应用价值。结果:宫颈癌组患者的血清SCC、M-CSF、Chemerin测定值高于CIN组患者，差异具有统计学意义(P<0.05);SCC、M-CSF、Chemerin鉴别诊断CIN患者的ROC曲线下面积分别为0.906、0.846、0.791;101例CIN患者中有Ⅰ期患者21例、Ⅱ期患者46例、Ⅲ期患者34例，随着CIN分期的增高，患者的SCC、M-CSF、Chemerin水平逐渐增高，各组之间差异具有统计学意义(P<0.05);HRwww.selleck.cn/products/dorsomorphin-2hcl-HPV DNA阳性CIlocal immunotherapyN患者的SCC、M-CSF测定值高于阴性组患者，各组之间差异具有统计学意义(P<0.05);在手术后3个月，CIN患者的SCC、M-CSF、Chemerin测定值均呈的降LY294002小鼠低趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:与宫颈癌患者相比，CIN患者的SCC、M-CSF、Chemerin测定值更低，但是随着CIN分级增高、HR-HPV DNA阳性表达患者的SCC、M-CSF、Chemerin水平更高，检查SCC、M-CSF、Chemerin水平能鉴别诊断CIN与宫颈癌。

三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen,是我国传统的名贵中草药之一,已有600多年的使用历史,具有散瘀止血、消肿定痛、益气活血的功效,目前常用于防治心脑血管类疾病。皂苷是三七的主要活性成分,也是用于临床使用的三七相关制剂的主要成分。现代药理研究表明,三七皂苷类成分具有抗血栓、扩张血管、抗炎、抗衰老、抗肿瘤及抗氧化等药效活性。如何对其进行高效、安全的提取一直是该领域研究的热点。目前,提取此类成分的方法仍然主要采用传统的加热回流、水煎醇沉、渗漉等方法,并且主要使用乙醇、水作为提取溶剂。然而,这些溶剂存在一些缺陷,如乙醇易燃、低浓度的醇在提取时容易产生糊化现象,水的提取效率相对较低等。因此,若能找到一种新型、绿色、有效的溶剂对三七皂苷类成分进行提取,不仅对优化三七提取工艺具有重要价值,也为未来三七及其他含皂苷类成分中药的开发应用提供重要的借鉴和思路。天然低共熔溶剂(nature deep eutectic solvents,NADES),指由一定化学计量比的氢键受体(如季铵盐、两性离子等)和氢键供体(如羧酸,多元醇、糖等)组合而成的两组分或三组分低共熔混合物,在室温条件为均一稳定的液体。NADES因其原料都为天然产物,价格低,可回收,是一种新型环境友好型溶剂,符合绿色化学的理念。此外,NADES还具有良好的生物相容性,具有生物降解性、可接受的生物毒性和可持续性等优势。近年来,NADES在药用植物活性成分的提取及分离纯化领域备受关注。由于某些NADES与目标活性成分之间能形成较多的氢键相互作用力,因此NADES常表现出优于传统溶剂的提取能力。因此,本研究拟将NADES应用于三七皂苷类成分提取工艺的优化过程中,并对NADES的细胞毒性及三七皂苷类成分NADES提取液的相关生物活性进行考察,主要研究结果如下:1.NADES初筛:首先通过文献检索,筛选出了24种适用于皂苷类成分extramedullary disease提取的NADES组分及配比。之后通过制备共获取了14种在室温下为均一稳定液体的NADES溶剂。2.NADES种类、组分配比、含水量的确定:通过测定三七皂苷类成分在上述NADES溶剂中的溶解度,并考察NADES组分配比、含水量对三七皂苷类成分提取率的影响,以三七皂苷类成分的溶解度及提取率作为工艺的评价指标,确定了含水为45%(v/v)的1:2的氯化胆碱/尿素为适用于三七皂苷类成分提取的NADES溶剂。3.超声辅助NADES提取三七皂苷类成分及提取工艺的优化:以三七皂苷类成分的提取率为指标,采用超声辅助NADES提取三七中皂苷类成分,并结合单因素和响应面实验设计优化出最佳提取工艺条件,即在提取温度为47℃、提取时间为36 min、液固比为40 m L/g条件下,可实现三七皂苷类成分提取率为71.97 mg/g,与70%(v/v)甲醇的提取效果(70.89 mg/g)相当,优于水(65.60mg/g)的提取效果。4.NADES可回收性的初步考察:采用HPD101型大孔吸附树脂对三七皂苷类成分NADES提取液中的皂苷类成分进行初步的回收,皂苷类成分的回收率达84.57%,并且NADES体积回收率为75.76%。随后,根据优化的提取方法,回收的NADES对三七皂苷类成分的二次提取率为70.22 mg/g,与第一次提取(71.97mg/m L)效果相当。5.NADES的细胞毒性研究:使用噻唑蓝比色法和苏木素-伊红染色法考察了NADES对RAW264.7、HEK293及A549细胞的细胞毒性。与已发表的相关ILs的细胞毒性的研究结果相比,NADES具有相对较大的IC_(50)值,即表现出相对较小的细胞毒性。6.三七皂苷类成分NADES提取液的生物活性研究:(1)三七皂苷类成分NADECP-456773临床试验S提取液的抗炎活性研究表明,三七皂苷类成分NADES提取液对肿瘤坏死因子α和白介素1βm RNA表达的抑制作用优于水提液,且呈剂量依赖关系。(2)三七皂苷类成分NADES提取液的抗氧化活性研究表明,相比于水提液,三七皂苷类成分NADES提取液具有较强的OH自由基和ABTS自由基清除能力。(3)三七皂苷类成点击此处分NADES提取液的抗凝血活性研究表明,在考察的生药浓度范围内(1.5625-25 mg/m L),与空白组(生理盐水)相比,仅浓度为25 mg/m L的三七皂苷类成分NADES提取液能显著延长活化部分凝血酶时间(P<0.05);12.5和25 mg/m L的三七皂苷类成分NADES提取液能显著延长凝血酶原时间(P<0.05),其他剂量组无统计学意义,说明一定浓度的三七皂苷类成分NADES提取液具有较强的抗凝血活性。综上所述,通过对超声辅助NADES提取三七皂苷类成分工艺条件的优化,表明NADES可作为传统有机溶剂的有效的、绿色的和可持续的替代品,用于从三七中提取皂苷类活性成分。此外,NADES不仅具有相对较小的细胞毒性,而且其三七皂苷类成分NADES提取液整体上表现出较强的抗炎、抗氧化和抗凝血活性。这为今后NADES在中药制药领域中应用与创新发展提供了思路和有价值的参考。

Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)是宿主细胞响应病原体感染时合成和释放的一种细胞因子,它能诱导干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表达从而抑制病毒复制。抗病毒固有免疫在宿主抵御病毒感染中发挥重要作用,主要通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PR寻找更多Rs)识别病毒来源的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),激活下游信号级联反应,启动IFN-Ⅰ免疫应答从而阻止病毒的入侵。然而,过度炎症激活会造成细胞因子风暴,导致机体损伤。因此,抗病毒天然免疫信号通路受到严格调控,泛素化修饰在其中扮演重要角色。TRIM蛋白家族作为E3泛素连接酶家族,能够以不同类型的连接方式对靶蛋白进行多聚泛素化修饰。鱼类TRIM家族既包括与哺乳动物同源的TRIM,也包括鱼类特有的TRIM(Fish novel tripartite motif,FTR)。目前,FTR在抗病毒天然免疫调控中的作用机制研究相对匮乏。本论文从鲤鱼中鉴定得到了一种鱼类特有的fin TRIM85(命名为CcFTR85),并对其调控IFN-Ⅰ表达的分子机制进行深入探究。我们从鲤鱼中克隆得到了CcFTR85基因的ORF(Open reading frame,ORF)区,其全长为1422 bp,编码474个氨基酸,预测蛋白分子量为54.2 k Da。系统进化分析显示,CcFTR85与FTR家族成员聚为一支,且与红鳍鲫(Carassius gibelio)FTR85的亲缘关系最近。首先,我们对CcFTR85在SVCV(Spring viremia of carp virus,SVCV)病毒感染和病毒类似物poly(I:C)、poly(d A:d T)selleck NMR刺激后的表达模式进行分析。q RT-PCR结果表明,SVCV刺激后CcFTR85在鲤鱼各免疫组织中的表达均上调;在外周血白细胞中,poly(I:C)和SVCV刺激后,CcFTR85的表达显著上调,而poly(d A:d T)刺激后,其表达没有显著性变化。表明CcFTR85参与RNA病毒感染免疫应答。病毒蚀斑实验和q RT-PCR表明,EPC细胞中过表达CcFTR85显著增强SVCV病毒复制。随后,我们对CcFTR85参与病毒感染促进病毒复制的机制进行了探讨。q RT-PCR及荧光素酶报告基因实验结果显示,CcFTR85可显著抑制poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ及其干扰素刺激基因(ISG15、PKR、Viperin)的表达,且呈现剂量依赖性。q RT-PCR与荧光素酶报告基因实验进一步表明,CcFTR85可以抑制RIG1、MDA5、c GAS、STING、TBK1、MAVS、IRF3及IRF7介导的IFN-Ⅰ、ISG15、PKR和Viperin的表达。为了确定CcFTR85的靶蛋白,我们进行了免疫共沉淀实验。结果显示,CcFTR85只与IRF3相互作用,而不与RIG1、MDA5、c GAS、STING、TBK1、MAVS和IRF7互作;随后,我们通过激光共聚焦显微镜观察发现,CcFTR85与IRF3共定位。病毒蚀斑实验和q RT-PCR实验进一步证明,CcFTR85减弱IRF3对SVCV病毒复制的抑制。我们又探究了CcFTR85调控IRF3的方式和机制。Western Blot实验表明,CcFTR85过表达能显著降解IRF3,且呈现剂量依赖性。放线菌酮追逐实验证明,CcFTR85加剧了IRF3及p-IRF3的不稳定性。Western Blot结果显示CcFTR85可显著抑制内源性IRF3及pIRF3的表达。非变性聚丙酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)结果表明,CcFTR85抑制IRF3二聚化。免疫荧光实验和Western Blot实验进一步证明,CcFTR85抑制p-IRF3入核。为了探究CcFTR85通过何种方式降解IRF3,我们进行了免疫共沉淀实验分析。结果表明,MG132处理后可以逆转CcFTR85对IRF3的降解,且CcFTR85显著增强IRFForensic Toxicology3的多聚泛素化修饰。为了确定CcFTR85对IRF3的泛素化修饰类型,将CcFTR85、IRF3与一组泛素突变体(K6、K11、K27和K48)共转染293T细胞,发现CcFTR85显著增强IRF3 K48位连接的泛素化。而将K48Ub突变为K48RUb时,CcFTR85对IRF3泛素化减弱。最后,我们对CcFTR85与IRF3互作的结构域进行了分析。我们分别构建了CcFTR85和IRF3不同结构域的缺失突变体,并进行了免疫共沉淀实验。结果表明CcFTR85通过其PRY-SPRY结构域与IRF3相互作用,IRF3通过其IAD结构域与CcFTR85相互作用。我们通过q RT-PCR和免疫共沉淀实验探究CcFTR85发挥负调控功能的结构域。结果表明,与全长CcFTR85相比,缺失RING结构域的CcFTR85对IRF3介导的IFN-Ⅰ表达的抑制作用消失,且显著削弱对IRF3的多聚泛素化修饰。本论文揭示了CcFTR85通过K48位泛素化修饰靶向降解IRF3负调控IFN-Ⅰ的抗病毒天然免疫反应的机制,为鱼类FTR在天然免疫调控中的作用机制提供新的见解。

目的:失血性休克是一种低血容量性休克,严重失血导致组织缺血缺氧。液体复苏会引起缺血再灌注损伤。细胞缺氧及复氧诱导的炎症反应是缺血再灌注损伤的重要机制。巨噬细胞是固有免疫的核心组成部分,对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)敏感,过度分泌多种炎症因子引起重要脏器的损伤。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体作为炎症反应的重要组成,主要表达于巨噬细胞中。NLRP3炎症小体活化后,引起细胞焦亡,分泌IL-1β和IL-18,导致过度的炎症反应。近期有证据表明,H/R巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎症小体活化,诱导过度的炎症反应。然而,目前尚无有效的药物抑制HS后液体复苏导致的缺血再灌注损伤,对于H/R诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化也没有有效的靶点。Hasan B.Alam课题组发现在失血性休克动物模型中,组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylases 6,HDAC6)特异性抑制剂妥巴司汀A(Tubast寻找更多atin A,Tub A)可以有效提高HS时大鼠的存活率,减轻重要脏器的损伤。此外,在脓毒症的模型中,他们发现Tub A可以有效抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和尼日利亚菌素联合刺激诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化。然而,其具体机制尚不清楚。Tub A通过抑制巨噬细胞RAW264.7中HDAC6,进而抑制热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)。抑制巨噬细胞中Hsp90导致诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS),活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)含量降低。而在缺氧/复氧的巨噬细胞中,降低ROS含量,可以抑制NLRP3炎症小体活化。因此,Tub A可能通过抑制H/R巨噬细胞中HDAC6,抑制Hsp90,进而抑制i NOS,导致ROS的生成减少,削弱NLRP3炎症小体活化。本研究通过构建巨噬细胞H/R模型,探索Tub ATezacaftor分子量对H/R巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的影响。研究方法:本研究以巨噬细胞RAW264.7作为体外研究对象。首先使用CCK8检测0、2.5、5、10μM Tub A下缺氧6h/复氧6h巨噬细胞RAW264.7活性,以选择Tub A的适宜干预浓度。随后将巨噬细胞RAW264.7随机分为三组(1)Ctrl组:先21%O_2下饥饿培养基培养6h,后21%O_2下完全培养基培养6h;(2)H/R组:先1%O_2下饥饿培养基培养6h,后21%O_2下完全培养基培养6h先缺氧6h后复氧6h;(3)Tub A组:缺氧6h加复氧6h的同时给予2.5μM Tub A治疗。荧光显微镜观察细胞内ROS含量变化。Western Blot法检测细胞内HDAC6、Hsp90、i NOS、NLRP3、GSDMD、Caspase-1,GSDMD-N、Caspase-1 p20表达。ELSIA法检测细胞培养液中的细胞因子IL-1β和IL-18水平。结果:(1)选择2.5μM Tub A对H/R巨噬细胞RAW264.7进行干预。(2)与Ctrl组相比,H/R组细胞中HDAC6、Hsp90、i NOS表达显著增加。与H/R组相比,Tub A组HDAC6、Hsp90、i NOS表达显著减少。(3)与Ctrl组相比,H/R组细胞中ROS含量增加。与H/R组相比,Tub A组ROS含量减少。(4)与Ctrl组相比,H/R组细胞中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、Caspase-1 pinternal medicine20表达显著增加。与H/R组相比,Tub A组NLRP3、GSDMD、Caspase-1,GSDMD-N、Caspase-1 p20表达显著减少。(5)与Ctrl组相比,H/R组细胞上清液中IL-1β和IL-18的分泌显著增加。与H/R组相比,Tub A组IL-1β和IL-18的分泌显著减少。结论:本研究发现HDAC6特异性抑制剂Tub A可以抑制H/R巨噬细胞中HDAC6,Hsp90,i NOS的表达,减少ROS的含量,进而抑制NLRP3炎症小体活化,减少IL-1β和IL-18分泌。

随着人口快速增长和老龄化进程加剧,全球癌症发病率和死亡率呈现快速增长趋势。借助生物成像,获取关于肿瘤性质、大小、位置及边界等更为详细的诊断信息,对肿瘤的诊断和治疗指导及效果评估有重要意义。具有较低细胞或活体毒性、较高发光效率、较好生物相容性等优势的荧光探针在生物成像中应用前景广阔。本文围绕人血清蛋白HSA结构特点,以高灵敏度强特异性荧光成像为探针设计目标,设计并构建了系列血清蛋白结构依赖的新型荧光探针。具体工作如下:1.基于HSA的结构,设计合成荧光探针DNPM和MPM。DNPM对HSA具有特异性响应性,且与HSA的结合能力较强。虽然MPM对HSA有较强的结合能力,Biocompatible composite但是它对HSA仅有弱特异性响应性。两种荧光探针在HSA的site Ⅰ位点和site Ⅱ位点均发生结合。DNPM对HSA具有较强的选择性敏感性,DNPM对HSA的检测限为0.16μM。DNPM活细胞成像依赖于HSA浓度。2.针对HSA净电荷为负,设计了含阳离子末端的ICT探针TAB2/6。该种荧SAG纯度光探针具有良好的蛋白响应性和HSA结合能力,仅在HSA的site Ⅱ位点发生结合。TAB2/6能与水溶性柱[5]芳烃(WP5)形成复合物。WP5?TAB2/6保留了TAB2/6的血清蛋白选择性响应性和较强的结合能力。WP5?TAB2和WP5?TAB6对HSA的响应灵敏度分别为0.07μM和0.75μM。形成的复合物能避免荧光氨基酸和常见金属离子的干扰。WP5与TAB2/6形成的两亲复合物自组装成囊泡状超分子荧光探针,具有良好的药物负载率(WP5?TAB2:55.1%,WP5?TAB6:70.4%)。WP5?TAB2/6还对Hela细胞具有良好的成像性能,且能够增强药物对细胞增殖抑制效果。3.基于TAB2结构,结合HSA的结构特点,设计共轭度更高的ICT荧光探针OTB。OTB相较于荧光探针TAB2,激发和发射波长均红移。该荧光探针对HSA具有良好的响应性和结合能力,在HSA的site Ⅰ位点和site Ⅱ位点均结合。OTB与WP5形成的复合物对多种类型的药物(如抗癌药、抗炎药、抗精神病药等)具有良好的抗干扰能力。此外,该复合物ZD1839临床试验在特定光照下能产生活性氧。WP5?OTB在水溶液中自组装形成囊泡状超分子荧光探针,具有一定的药物负载性能。WP5?OTB对Hela细胞表现出HSA依赖性的细胞成像能力,能够增强药物的抗癌活性。4.新设计一种具有内源荧光的荧光探针MBD。该探针因阳离子的引入而具有血清蛋白响应性。它主要在HSA的site Ⅰ位点结合,具有较强的结合能力。MBD与WP5形成的复合物保留了 MBD的特性。WP5?MBD在水溶液中自组装形成粒径大小分布均匀的囊泡状超分子荧光探针,该探针的载药率约为64.4%。WP5?MBD对Hela细胞具有良好的活细胞成像能力。

糖基化作为最丰富的翻译后修饰,广泛影响着各类蛋白和脂质的功能。O-Glc NAcylation作为细胞核和细胞质蛋白上的一种独特的糖基化修饰和细胞转录、蛋白翻译等多项生理过程息息相关。OGT作为一种将O-Glc NAc添加到目的蛋白上的酶,在包括癌症、糖尿病、神经退行性疾病等多种疾病中异常表达。目前OGT的小分子抑制剂种类较为单一,选择性低,主要通过结合供体底物UDP-Glc NAc口袋从而抑制OGT活性,该过程可能会影响细胞内其他糖基化修饰。因此,寻找具有新结合模式的靶向OGT的小分子抑制剂成为了本课题的研究目标。本课题研究工作主要分为三个方面:一、HTRF高通量筛选方法的建立。通过构建、表达和纯化OGT,建立了基于OGT酶活功能的HTRF高通量筛选体系,并测试了体系的稳定性和可行性。二、OGT小分子抑制剂的筛选和确证。利用HTRF高通量筛选体系筛选了1966个化合物,确定了苗头化合物CDDO,IC_(50)=6.56±1.69μM。~1H-NMR和MST证明CDDO与OGT直接结合,K_d=1.7μM。HDX-MS证明CDDO结合在OGT的TPR域和N端结构域所形成的口袋中,酶活竞争实验验证了HDX-MS结果,证明OSMI-4的浓度变化不会影响CDDO的IC_(50)值。建立了Alpha Screen的方法来验证CDDO类似物对OGT的抑制LY2835219活性,最后使用分子对接预测CDDO及其类似物的结合模式。分子对接预测CDDO及其结构类似物的活性变化是由于和Leu492和Asn526形成了不同数量和距离的氢键。三、OGT结构解析。通过培养OGT-CDDO的共结晶蛋白来验证分子对接的预测结果。通过改善OGT纯化条件、空晶蛋白的池液条件和Soaking时间等方面提高晶体质量,最终得到了分辨率为3.8?的OGT蛋白空晶,后续将继续对晶体培养条件进行优化来分析CDDO和OGT的具体结合模式。在本课题中,通过高通量筛选发现和确证了靶向OGT的小分子抑制剂。现有的OGT抑制剂大部分结合在催化区域,CDDO被首次发现结合在TPR域和N端结构域的口袋中。CDDO及其类似物对OGT均有不同程度的抑制作用,且具有良好的改造前景。综上所述,本课题首次开发了基于OGT酶活功能的HTRF高通量筛选方法。发现并确证了具有新型结合位点的小分子抑制剂CDDO。最后pulmonary medicine运用计算机辅助药物设计,预测了CDDO的结合模式,此网站为后续OGT抑制剂的发现和改造奠定良好的基础。

目的：探讨补脾强力复方对亚甲减并实验性自身免疫性重症肌无力（ExperimentalAutoimmuneMyastheniaGravis，EAMG）大鼠下丘脑-垂体-甲状腺-JQ1体内实验剂量胸腺（Hypothalamic-pituitary-thyroid-thymus，HPTT）轴功能的修复作用，为补脾强力复方从神经-内分泌-免疫角度治疗重selleck产品症肌无力及其共病寻找理论依据。方法：动物实验通过甲巯咪唑灌胃45天及含鼠源性AchR- sα亚基 97-116 肽段序列（R97-116）免疫乳剂皮下注射建立合并亚甲减的EAMG大鼠模型，随机分为模型组（Model group，M组）、泼尼松组（Prednisone group，P组）、补脾强力复方低剂量组（Low dose of Bupiqiangli decoction group，LBD组）、补脾强力复方中剂量组（Middle dose of Bupiqiangli decoction group，MBD组）、补脾强力复方高剂量组（High dose of Bupiqiangli decRational use of medicineoction group，HBD组），加上正常大鼠作为对照组（Control group，C组）各8只。各组大鼠给予相应药物28天同时进行行为学观察后分别处死，取血通过ELISA法检测大鼠血清AchR-Ab、TSH、TRH、T3、T4含量及TNF-α、TGF-β、IL-4、IL-17相关细胞因子含量。结果：建模后各组大鼠体质量相对C组明显下降（P＜0.01），给药后取材前，M组大鼠较各治疗组体质量明显降低（P＜0.01）；与LBD组相比，HBD组、P组大鼠体质量升高具有明显统计学意义（P＜0.01）。治疗后M组大鼠Lennon评分趋势进一步升高，LBD组、MBD组较给药前症状变化不明显，HBD组与P组Lennon评分降低。与M组相比，LBD组、MBD组、HBD组、P组大鼠血清AchR-Ab、TSH、TRH、TNF-α、IL-4、IL-17均下降，TGF-β均升高（P＜0.05），其中均以HBD组、P组变化更为明显（P＜0.01）。然而T3、T4、fT4变化不明显。结论：补脾强力复方各组能一定程度上改善合并亚甲减的EAMG大鼠行为学异常，包括体质量和Lennon等级，其中高剂量组能够明显改善大鼠临床症状。同时补脾强力复方能够修复损伤的HPTT轴，调节该轴各个靶器官释放的激素水平，使其向正常机体的分泌水平靠近。