ALK抑制剂

目的 分析2019年潍坊市一株登革病毒(Weiselleck激酶抑制剂fang 2019)全基因组序列及关键性氨基酸位点的突变情况。方法 收集登革病毒感染病例的血清样本，对初检阳性样本进行病毒分离、全基因组测序，构建进化树，对该序列进行核苷酸/氨基酸相似性分析。结果 本研究中，分别以登革病毒1型(DENV-1)参考毒株(NC＿001477.1)和原型株(EU848545.1)为对照，Weifang 2019核苷酸基因组的全序列分别检出94个和95个氨基酸位点突变，其中有57个突变位点一致。其中，3个结构蛋白和7个非结构蛋白均存在突变，蛋白NS5、E和NS1位点突变占比前3位。核苷酸序列和氨基酸序列分析发现Weifang2019与Guangdong 2014(99.5%/99.3%)、Wenzhou CH-223191说明书2014(99.6%/99.4%)、Guangdong 2016(99.4%/99.2%)、Henan 2014(99.5%/99.3%)处于同一进化分支，且相似性均大于99%。结论 2019年潍坊地区一株登革病毒Weifang 2019与Guangdong 2014(MN018287.1)、Wenzhou 2CMV infection014(KR024708.1)、Guangdong 2016(MN018286.1)和Henan 2014(KP686070.1)的遗传距离较近、相似性较高，提示Weifang 2019可能由上述地区毒株遗传进化而来。

下胚轴是位于子叶和根之间重要的胚性器官。植物种子萌发时下胚轴的迅速伸长,使胚根及胚芽突破种皮,令植物的生命活动正常进行。此外下胚轴还是研究细胞伸长重要的模式系统。因此研究下胚轴的伸长具有重要的意义。植物下胚轴的伸长生长受到许多内外因素的影响:例如光照,钙离子,生长素等。黄素单加氧酶YUCCAs(YUCs)是生长素合成IPy A途径中的限速酶。实验室前期研究发现与拟南芥野生型confirmed cases相比,光照条件下YUC7过表达材料下胚轴变长,而黑暗条件下的YUC7过表达材料下胚轴变短,但具体的调控机制却不清楚。因此本文对YUC7在光照和黑暗条件下调控拟南芥下胚轴伸长的分子机制进行了研究。本实验以拟南芥野生型(wild type,WT)、yuc7、YUC7过表达(YUC7-OE#7、YUC7-OE#8)、PIF3-OE、P_(YUC7)::GUS、DR5::GUS、yuc7×DR5::GUS,PIF3-OE×yuc7为材料,分别在黑暗条件下培养5 d和光照条件下培养7 d,进行以下实验:分析P_(YUC7)::GUS植株不同部位YUC7启动子活性;观察并统计WT、YUC7-OE和yuc7植株下胚轴长度;分析WT和yuc7植株中生长素分布情况并测定其生长素含量;观察并统计WT、YUC7-OE#7和yuc7下胚轴表皮细胞长度;检测WT和PIF3-OE中YUC7的表达量变化;观察并统计WT、PIF3-OE和PIF3-OE×yuc7下胚轴长度,得到结果如下:(1)GUS染色发现P_(YUC7:):GUS中的YUC7基因启动子活性在黑暗条件下培养的材料下胚轴中上部即快速伸长区最高。(2)光照条件下培养7 d的YUC7-OE下胚轴显著长于WT,而黑暗条件培养5d的YUC7-OE下胚轴短于WT,yuc7则表现出相反的表型。表明YUC7在光照条件下促进而在黑暗条件下抑制下胚轴的伸长。(3)与DR5::GUS相比,yuc7×DR5::GUS植株中GUS染色显著变浅;进一步使用LC-MS测定生长素含量,发现光照和黑暗条件下生长的yuc7植株生长素含量均低于WT,表明YUC7在光照和黑暗条件下均正调控生长素合成。(4)下胚轴细胞表型分析发现,与WT相比,光照条件下培养7 d的YUC7-OE植株下胚轴细胞显著变长,黑暗条件下培养5 d的YUC7-OE植株下胚轴中部和下部细胞明显变短,yuc7表现出与YUC7-OE相反的表型。说明YUC7在光照条件下促进而在黑暗条件下抑制下胚轴细胞的伸长。(5)检测WT和PIF3-OE植株中YUC7的表达量,发现与相同生长条件下的WT相比,下PIF3-OE植株中YUC7的表达点击此处量在光照条件显著上调,而黑暗条件下则显著下调,表明PIF3在光下促进而在暗下抑制YUC7的表达。(6)观察并统计WT、PIF3-OE和PIF3-OE×yuc7植株下胚轴表型,发现yuc7可以部分恢复光照条件下PIF3-OE下胚轴长长的表型,但黑暗条件下却不能恢复。综上所述,生长素合成酶基因YUC7可能受PIF3的调控通过调节下胚轴细Mirdametinib试剂胞的伸长进而在光照和黑暗条件调控下胚轴的伸长。

关节骨软骨损伤是晚年发展成骨关节炎(OA)的一个重要危险因素,并且软骨损伤后自我修复能力有限,同时伴随着软骨下骨的退化和病变,因此需要进行骨软骨的治疗与修复。传统的骨软骨缺损治疗手段各有不足,难以重建关节骨软骨的多层功能性结构,组织工程则是近年来治疗骨软骨缺损的最有希望的手段。理想的骨软骨组织工程Gefitinib小鼠支架需要具备良好的机械性能、类似细胞外基质(ECM)的理化性能,同时具有诱导组织再生的优异的生物活性,水凝胶材料在上述方面具有较大的优势。生物3D打印技术作为制造支架的新技术,能够根据要求构建出个性化支架,具有不同的孔洞和分层结构,可有效模拟天然组织的组织复杂性和梯度结构。因此,本文通过模拟天然关节骨软骨的分层结构,基于水凝胶与ECM高度相似的性质以及生物3D打印技术,构建出双层定向的骨/软骨一体化支架,以期实现诱导骨软骨一体化修复再生。关节软骨由分布在ECM中的软骨细胞组成,因此,为了治疗软骨损伤,应该适当地制造ECM。选用甲基丙烯酸酯化明胶(Gel MA)、壳selleck NMR聚糖(CS)和丝素蛋白(SF),制备了一系列GMA/CS/SF软骨层水凝胶油墨,并优化出最佳组分5GMA/5CS/7SF作为软骨层支架的打印油墨。采用3D生物打印和定向冷冻技术,结合双网络交联机理,成功构建出5GMA/5CS/7SF软骨层水平/垂直定向支架,并与非定向组进行对比。实验结果表明,5GMA/5CS/7SF软骨层支架的水平定向组和垂直定向组均呈现出具有取向的线型孔隙结构;水平定向结构和垂直定向结构降低了含水率和溶胀率,提高了孔隙率,可达88%以上;水平定向结构具有更小的接触角和适宜的降解率,在第23天时降解至50%,且水平定向结构改善了软骨层支架的抗压能力和结构稳定性,弹性模量和最大抗压强度分别可达0.08MPa和0.07MPa;水平定向组支架和垂直定向组支架均无细胞毒性,且更有利于细胞增殖,同时具有更高的硫酸糖胺聚糖含量,能够为ATDC5细胞提供优良的软骨组织分化环境。对于软骨下骨层的修复,不仅要考虑材料的强度,还需要具有优良的生物活性和骨诱导活性,因此,选用甲基丙烯酸酯化明胶、海藻酸钠(SA)和羟基磷灰石(HA)制备了一系列GMA/SA/HA软骨下骨层水凝胶油墨,并优化出最佳组分5GMA/5SA/7.5HA作为软骨下骨层支架的打印油墨。采用生物3D打印和定向冷冻技术,结合双网络交联机理,成功构建出5GMA/5SA/7.5HA软骨层水平/垂直定向支架,并与非定向组进行对比。实验结果表明,5GMA/5SA/7.5HA软骨下骨层支架的水平定向组和垂直定向组均呈现出具有取向的线型孔隙结构;水平定向结构和垂直定向结构降低了含水率和溶胀率,提高了孔隙率,可达80%以上,且垂直定向结构具有亲水性和较为适宜的降解率,在第44天时降解至65%左右;垂直定向结构改善了软骨下骨层支架的抗压能力和结构稳定性,弹性模量和最大抗压强度分别可达0.16MPa和0.13MPa;水平定向组支架和垂直定向组支架均无细胞毒性,且更有利于细胞增殖,垂直定向组支架具有更优异的矿化能力和更好的早期、中后期促成骨分化能力。根据天然的骨软骨结构,骨与软骨并不是两个单独存在的部分,而是由过渡层将软骨与骨紧密连接成的一个整体。因此选用5GMA/5CS/7SF和5GMA/5SA/7.5HA分别模拟软骨层和软骨下骨层,选用Gel MA、CS和多巴胺(DA)作为过渡层增加结合力(剪切力可达10KPa),采用3D打印和定向冷冻技术构建出双层定向骨/软骨一体化支架(软骨层水平定向、软骨下骨层垂直定向),并与双层非定向组进行对比。实验结果表明,双层定向的支架能够观察到明显的上层水平取向、下层垂直取向的结构,且过渡层部分结合良好;双层定向结构支架有较高的含水率和溶胀率,孔隙率略微下降,但仍保持在70%以上;双层定向结构改善了骨/软骨支架的抗压能力和结构稳定性;双层定向骨/软骨支BH4 tetrahydrobiopterin架的上层水平取向和下层垂直取向的结构有助于促进细胞的成软骨和成骨增殖分化,有潜力促进骨软骨组织的修复再生。

关节骨软骨损伤是晚年发展成骨关节炎(OA)的一个重要危险因素,并且软骨损伤后自我修复能力有限,同时伴随着软骨下骨的退化和病变,因此需要进行骨软骨的治疗与修复。传统的骨软骨缺损治疗手段各有不足,难以重建关节骨软骨的多层功能性结构,组织工程则是近年来治疗骨软骨缺损的最有希望的手段。理想的骨软骨组织工程Gefitinib小鼠支架需要具备良好的机械性能、类似细胞外基质(ECM)的理化性能,同时具有诱导组织再生的优异的生物活性,水凝胶材料在上述方面具有较大的优势。生物3D打印技术作为制造支架的新技术,能够根据要求构建出个性化支架,具有不同的孔洞和分层结构,可有效模拟天然组织的组织复杂性和梯度结构。因此,本文通过模拟天然关节骨软骨的分层结构,基于水凝胶与ECM高度相似的性质以及生物3D打印技术,构建出双层定向的骨/软骨一体化支架,以期实现诱导骨软骨一体化修复再生。关节软骨由分布在ECM中的软骨细胞组成,因此,为了治疗软骨损伤,应该适当地制造ECM。选用甲基丙烯酸酯化明胶(Gel MA)、壳selleck NMR聚糖(CS)和丝素蛋白(SF),制备了一系列GMA/CS/SF软骨层水凝胶油墨,并优化出最佳组分5GMA/5CS/7SF作为软骨层支架的打印油墨。采用3D生物打印和定向冷冻技术,结合双网络交联机理,成功构建出5GMA/5CS/7SF软骨层水平/垂直定向支架,并与非定向组进行对比。实验结果表明,5GMA/5CS/7SF软骨层支架的水平定向组和垂直定向组均呈现出具有取向的线型孔隙结构;水平定向结构和垂直定向结构降低了含水率和溶胀率,提高了孔隙率,可达88%以上;水平定向结构具有更小的接触角和适宜的降解率,在第23天时降解至50%,且水平定向结构改善了软骨层支架的抗压能力和结构稳定性,弹性模量和最大抗压强度分别可达0.08MPa和0.07MPa;水平定向组支架和垂直定向组支架均无细胞毒性,且更有利于细胞增殖,同时具有更高的硫酸糖胺聚糖含量,能够为ATDC5细胞提供优良的软骨组织分化环境。对于软骨下骨层的修复,不仅要考虑材料的强度,还需要具有优良的生物活性和骨诱导活性,因此,选用甲基丙烯酸酯化明胶、海藻酸钠(SA)和羟基磷灰石(HA)制备了一系列GMA/SA/HA软骨下骨层水凝胶油墨,并优化出最佳组分5GMA/5SA/7.5HA作为软骨下骨层支架的打印油墨。采用生物3D打印和定向冷冻技术,结合双网络交联机理,成功构建出5GMA/5SA/7.5HA软骨层水平/垂直定向支架,并与非定向组进行对比。实验结果表明,5GMA/5SA/7.5HA软骨下骨层支架的水平定向组和垂直定向组均呈现出具有取向的线型孔隙结构;水平定向结构和垂直定向结构降低了含水率和溶胀率,提高了孔隙率,可达80%以上,且垂直定向结构具有亲水性和较为适宜的降解率,在第44天时降解至65%左右;垂直定向结构改善了软骨下骨层支架的抗压能力和结构稳定性,弹性模量和最大抗压强度分别可达0.16MPa和0.13MPa;水平定向组支架和垂直定向组支架均无细胞毒性,且更有利于细胞增殖,垂直定向组支架具有更优异的矿化能力和更好的早期、中后期促成骨分化能力。根据天然的骨软骨结构,骨与软骨并不是两个单独存在的部分,而是由过渡层将软骨与骨紧密连接成的一个整体。因此选用5GMA/5CS/7SF和5GMA/5SA/7.5HA分别模拟软骨层和软骨下骨层,选用Gel MA、CS和多巴胺(DA)作为过渡层增加结合力(剪切力可达10KPa),采用3D打印和定向冷冻技术构建出双层定向骨/软骨一体化支架(软骨层水平定向、软骨下骨层垂直定向),并与双层非定向组进行对比。实验结果表明,双层定向的支架能够观察到明显的上层水平取向、下层垂直取向的结构,且过渡层部分结合良好;双层定向结构支架有较高的含水率和溶胀率,孔隙率略微下降,但仍保持在70%以上;双层定向结构改善了骨/软骨支架的抗压能力和结构稳定性;双层定向骨/软骨支BH4 tetrahydrobiopterin架的上层水平取向和下层垂直取向的结构有助于促进细胞的成软骨和成骨增殖分化,有潜力促进骨软骨组织的修复再生。

目的:改善鲜切香菇的保鲜效果。方法:以火龙果皮和乙二胺为原料合成碳量子点，并表征其稳定性和毒性。以鲜切香菇为研究对象，分别使用0.0,1.5,3.0,4.5 mL/100 mL的碳量子psychiatric medication点—壳聚糖涂膜液(N-CDs/CH)进行保鲜处理后4℃贮藏10 d,其间每24 h测定其失重率Naporafenib配制、色差、可溶性固形物和多酚氧化酶等指标，以评价3-MA价格复合膜的保鲜效果。结果:合成的碳量子点荧光稳定性良好，外表面含有羟基、氨基等官能团，且无细胞毒性，具备典型碳量子点的特征。贮藏第10天，经4.5 mL/100 mL碳量子点—壳聚糖涂膜液处理的失重率为3.31%,色度为10.32,可溶性固形物含量为4%,多酚氧化酶(PPO)活性为104.65 U/(kg·s),各项指标均显著优于空白组及其他处理组(P<0.05)。结论:采用4.5 mL/100 mL的碳量子点—壳聚糖涂膜液处理可以有效抑制鲜切香菇的水分流失和多酚氧化酶活性，改善香菇色泽，提升保鲜效果。

癌症是死亡率最高的疾病之一,其中肝癌的死亡率在癌症中排名第二,给人类生命健康以及家庭和社会带来了沉重的危害。在临床上,治疗肝癌最有效的方法是手术治疗,术前术后同步放疗和化疗,但是手术切除易复发,放疗和化疗副作用大,因此需要研发高效并具有靶向性的治疗肝癌的药物。盐酸阿霉素(Dox)是一种广谱的化疗药物,广泛应用于治疗多种癌症,例如脑胶质瘤、黑色素瘤等,由于Dox不具有特异性,它对心脏和肾脏的副作用成为了治疗肿瘤的瓶颈,为了减轻化学药物的副作用,载体药物递送成为了研究热点。核酸适配体能特异性的结合靶标,具有高亲和力,易于修饰和低免疫原性等优点,是治疗肿瘤的新兴药物,AS1411是第一个用在临床试验中的核酸适配体药物,它能靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,内化进入肿瘤细胞,并PEG300小鼠且对多种肿瘤细胞有抑制作用,是作为靶向药物载体很好的选择。核酸适配体作为药物或Bio-based chemicals药物载体通常需要通过改造或修饰,优化其结构提高稳定性和生物学活性,本课题以Dox为治疗肝癌的药物,将优化后的AS1411和Dox偶联,探索靶向药物对Hep G2的靶向性和有效性,并进一步研究Hep G2细胞凋亡机制。首先将AS1411通过镜像化处理、5’末端修饰5 k Da聚乙二醇(PEG),以及将序列中间13和24位的T碱基替换为2’-脱氧肌苷(2’-d I),得到三种AS1411衍生物AS1411-J、AS1411-X1和AS1411-X2,通过圆二色谱(CD)、核磁共振氢谱(NMR)、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞技术、荧光倒置显微镜和细胞毒性检测等对三种衍生物进行表征。研究结果表明AS1411、AS1411-J、AS1411-X1和AS1411-X2都具有稳定的G-四聚体结构,在血清中稳定性分别为8、12、12和24 h,和CCRG 81045抑制剂Hep G2细胞的亲和力分别为265.2±38.87、149.9±29.55、225.1±83.01和267.6±88.43 n M,特异性都较好,AS1411和AS1411-J具有较显著的抗肿瘤活性。然后将AS1411-J和Dox偶联,成功合成了靶向药物AS1411-J-Dox,通过细胞毒性和生理指标的检测评估了AS1411-J-Dox的靶向性和抗肿瘤活性。结果显示AS1411-J-Dox能降低Hep G2细胞的活性,而对正常肝细胞无显著影响,具有良好的抗肿瘤活性和靶向性,此外,AS1411-J-Dox也能抑制Hep G2细胞中SOD、GDH、GOT、GPT、T-GSH和LDH等酶的活性。最后通过流式细胞技术、荧光定量PCR和Western blot技术,研究了AS1411-J-Dox的抗肿瘤机制。结果表明,AS1411-J-Dox能将细胞阻滞于S期(19%)和G2/M(25.9%)期,并且可以通过上调p38和BAX的表达,下调Bcl-2表达来调控细胞凋亡。综上所述,AS1411-J稳定性较好、亲和力高、特异性强,是良好的靶向药物载体。偶联产物AS1411-J-Dox是一种具有潜在应用能力的靶向抗肿瘤药物,本研究为癌症的治疗和AS1411抗肿瘤机制的研究提供了参考。

目的:本研究初步探讨卵泡发育过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)合成受限介导多囊卵巢综合征(PCOS)颗粒细胞(GCs)凋亡的作用机制,为临床上改善PCOS卵泡发育障碍提供潜在的治疗靶点。方法:1.分析PCOS患者卵巢GCs m RNA的差异表达谱:从GEO数据库下载人卵巢GCs转录组数据,对差异表达基因进行生物信息学分析。2.来曲唑联合高脂饮食诱导建立PCOS大鼠模型,通过体重监测、阴道涂片监测动情周期、放射免疫法检测血清睾酮(T)和H&E染色观察卵巢形态等鉴定模型。3.ELISA、Western Blot(WB)分别检测PCOS大鼠卵巢中NAD~+、乳酸的含量,以及卵巢总蛋白的乙酰化水平。4.分析细胞凋亡相关因子(BAX、BCL-2和CASPASE-3)、NAD~+合成关键酶(烟酰胺磷酸核糖基转移酶,NAMPT)、NAD~selleck产品+依赖性去乙酰化酶(沉默信息调节蛋白2,SIRT2)和乳酸合成关键酶(乳酸脱氢酶A,LDHA)在PCOS大鼠卵巢中的表达变化:(1)q RT-PCR和WB检测各组大鼠卵巢中BAX、BCL-2、CASPASE-3、NAMPT、SIRT2和LDHA的m RNA和蛋白水平;(2)免疫组织化学法检测BAX、BCL-2、CASPASE-3、NAMPT、SIRT2和LDHA在大鼠卵巢的表达定位;(3)Pearson相关性分析用于评估NAD~+、乳酸与细胞凋亡相关因子的相关性。5.添加FK866抑制KGN细胞中NAMPT的表达:(1)CCK-8检测细胞活力;(2)流式细胞术、q RT-PCR和WB检测细胞凋亡率及凋亡相关因子的表达;(3)q RT-PCR、WB检测NAMPT、SIRT2和LDHA的表达;(4)ELISA检测细胞中NAD~+的含量;(5)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。6.在293T细胞中过表达LDHA的同时添加FK866抑制NAMPT的表达:(1)免疫共沉淀(Co-IP)技术检测LDHA的乙酰化;(2)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。7.添加AGK2抑制KGN细胞中SIRT2的表达:(1)q RT-PCR和WB检测SIRT2和LDHA的表达;(2)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。结果:1.分析PCOS患者和对照组妇女的卵巢GCs转录组数据后发现:二者共有207个基因在GCs中差异表达,其中上调的基因143个,下调的基因64个;GO和KEGG富集分析发现,糖酵解和烟酸-烟酰胺代谢通路被显著富集,热图聚类分析发现PCOS组中LDHA和SIRT2的表达显著下调。2.与对照组大鼠ML intermediate相比,PCOS组大鼠体重(3VEGFR抑制剂74.12±11.99 vs 270.13±8.67,P<0.01)显著增加,动情周期停滞在间期,血清T水平(4.85±1.48 vs0.25±0.20,P<0.01)明显升高,卵巢中囊性卵泡(11.33±2.42 vs 2.50±1.05,P<0.01)显著增多和黄体数量(3.50±1.05 vs 9.67±1.97,P<0.01)显著减少。3.PCOS组大鼠卵巢组织中NAD~+(0.44±0.04 vs 0.75±0.01,P<0.01)和乳酸(0.39±0.01 vs 0.50±0.03,P<0.05)的含量均显著降低,而总蛋白乙酰化显著增强。4.PCOS组大鼠卵巢GCs中BAX和CASPASE-3的表达显著上调(P<0.05),BCL-2、NAMPT、SIRT2和LDHA的表达均显著下调(P<0.05);通过Pearson相关性分析得出,PCOS大鼠卵巢组织中NAD~+水平与Bax(r=-0.98,P<0.01)、Caspase-3(r=-0.99,P<0.01)的表达呈显著负相关,与Bcl-2(r=0.99,P<0.01)的表达呈显著正相关,且NAD~+与乳酸水平(r=0.93,P<0.01)呈显著正相关。5.NAMPT沉默后,KGN细胞活力降低、凋亡率增高(P<0.05),BAX和CASPASE-3的表达显著上调(P<0.05),BCL-2、NAMPT、SIRT2和LDHA的表达显著下调(P<0.05)。6.在过表达LDHA的基础上沉默NAMPT,LDHA的乙酰化增强和乳酸(6.94±0.20 vs 8.55±0.55,P<0.05)的含量显著降低。7.SIRT2沉默后,KGN细胞中SIRT2、LDHA的表达显著下调(P<0.05),乳酸的含量显著降低(7.08±0.04 vs 7.46±0.18,P<0.05)。结论:PCOS大鼠卵巢中NAD~+和乳酸含量显著降低,GCs的凋亡显著增加。NAD~+合成受限可促进GCs的凋亡,提高LDHA的乙酰化水平并抑制其表达,阻滞糖酵解进程和降低乳酸水平,从而抑制卵泡发育所需的能量供应。

植物病原菌的检测与鉴定在保护我国农林业经济与生态安全方面有着重要意义,是检疫工作的重中之重。等温扩增技术具有高效、特异性,可快速实现即时检测,已被应用于检疫工作中。Bst DNA聚合酶是等温扩增中的核心酶,具有较强的热稳定性、链置换活性和聚合酶活性,在恒温条件下快速、高效、特异性地扩增模板。本研究前期基于环介导等温扩增技术(loop-mediated let-7 biogenesisisothermal amplification,LAMP)建立了核酸检测体系,但DNA提取过程中加入的表面活性剂一定程度上影响了体系中Bst酶的活性,导致实验结果不稳定、重复www.selleck.cn/products/AZD2281(Olaparib)性低。本研究拟基于已解析的Bst聚合酶蛋白结构,设计相关关键氨基酸位点的突变,并表达纯化这些Puromycin小鼠突变体,比较突变体与野生型的酶活力,最终设计出可耐受1%表面活性剂的高效突变体,从而建立Bst酶在植物病原物检测的稳定体系,为田间病害监测及进出口检疫工作提供预警信息。

急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一种常见的呼吸系统急危重症,死亡率高,目前缺乏有效的治疗手段。内皮糖萼是位于血管内皮细胞表面的多糖复合结构,它不仅是血管壁的选择性通透性屏障,还能限制血细胞与内皮细胞的接触,维持血管内皮的正常微环境。内皮糖萼的破坏会增加血管的通透性,加速肺水肿,促进急性肺损伤的发生与发展。在研究中,我们创新性地提出了以硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)为修复材料,将其种植在内皮糖萼缺损部位的内皮细胞膜上,以修复内皮糖萼的策略。首先,制备E-选择素结合肽(E-selectin-binding peptides,EBP)修饰并加载四嗪(Tetrazines,Tz)的膜融合脂质体(Fusion liposomes,FLs),利用EBP对炎症刺激的内皮细胞表面高表达的E-选择素的靶向性,将Tz锚定到内皮细胞膜上,然后注入反式环辛烯(Trans cyclooctene,TCO)修饰的HS。随后,Tz和TCO之间的生物正交反应可以将HS固定在内皮细胞膜上,从而修复内皮糖萼。并以急性肺损伤为疾病模型,阐明该给药系统如何修复内皮糖萼,为靶向修复内皮糖萼的新型药物制剂的研究和临床应用提供理论和实验依据。本研究主要包括以下6部分内容:1.材料合成及结构鉴定通过E-选择素结合肽(E-selectin binding peptide,EBP)上的巯基与马来酰亚胺-聚乙二醇-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(Maleimide-polyethylene glycol-dimethyl myristoyl phosphatidylethanolamine,DMPE-PEG-MAL)上的马来酰亚胺基团(Maleimide,MAL)发生加成反应,合成了能与E-选择素特异性结合的靶向脂质材料EBP-PEG-DMPE。其次,Tz与二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(Dimyristoylphosphatidylethanolamine,DMPE)通过酰化反应共价连接,合成锚定材料Tz-DMPE。最后,通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(N-hydroxysuccinimide,NHS)参与的酰化反应,在HS上修饰TCO,合成了糖萼修复材料TCO-HS。2.EBP-Tz-FLs处方工艺优化和理化性质表征采用薄膜分散法制备膜融合脂质体EBP-Tz-FLs。研究了(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵((2,3-dioloyl-propyl)-trimethylammonium chloride,DOTAP)含量、EBP-PEG-DMPE/Tz-DMPE质量比、超声时间、超声功率和水化体积对EBP-Tz-FLs粒径、电位及细胞摄取的影响。最终确定20%DOTAP、EBP-PEG-DMPE/Tz-DMPE质量比为5:4时是EBP-selleck MC3Tz-FLs的最佳处方,超声功率390 W、超声时间7 min、水化体积10 m L是制备EBP-Tz-FLs的最佳处方工艺。制备得到的EBP-Tz-FLs粒径为122.80±5.00 nm且分布均匀,电位为42.25±3.67 m V。透射电镜的结果显示EBP-Tz-FLs呈圆形的脂质体样结构,稳定性实验表明EBP-Tz-FLs在4℃下具有较好的稳定性。3.EBP-Tz-FLs和TCO-Cy5体外细胞学研究首先考察了温度以及能量抑制剂叠氮化钠(NaN_3)对EBP-Tz-FLs细胞摄取的影响,并利用荧光显微镜观察了与HUVECs孵育不同时间下EBP-Tz-FLs在细胞内的分布情况,实验表明EBP-Tz-FLs有较好的膜融合能力。利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建细胞炎症模型,并提前给予E-选择素结合肽竞争性结合E-选择素位点。结果说明:E-选择素结合肽的修饰使得EBP-Tz-FLs具有E-选择素靶向性。EBP的修饰能够将载有Tz的脂质体靶向递送至肺内皮细胞糖萼破损的部位,再给予TCO-Cy5,利用激光共聚焦和细胞流式分析仪测定TCO-Cy5的荧光强度,发现在给予EBP-Tz-FLsE7080供应商后有更多的TCO-Cy5能够修饰到HUVECs上。进一步,利用多功能酶标仪检测了细胞膜上TCO-Cy5的荧光强度,实验结果证明EBP-Tz-FLs+TCO-Cy5组在细胞膜上的分布最多。4.EBP-Tz-FLs和TCO-Cy5体内组织分布首先利用LPS滴鼻法成功构建了急性肺损伤小鼠模型。将DID标记的EBP-Tz-FLs(EBP-Tz-FLs@DID)静脉注射入急性肺损伤小鼠体内,在各个时间点下其在肺部的荧光强度强于没有EBP肽修饰的膜融合脂质体。结果表明EBP肽的修饰能够使膜融合脂质体靶向至急性肺损伤小鼠的肺组织。随后,先将EBP-Tz-FLs尾静脉注射入血,1 h后将TCO-Cy5注射入小鼠体内。结果显示EBP-Tz-FLs+TCO-Cy5在实验的整个过程中,都较其他组更多地分布在肺组织中,且持续时间更长。5.评估EBP-Tz-FLs+TCO-HS对糖萼的修复以及急性肺损伤的治疗效果利用LPS构建炎症刺激后的内皮细胞模型,给药后用FITC标记的麦胚凝集素(FITC labelled wheat germ agglutinin,FITC-WGA)来标记内皮糖萼,EBP-Tz-FLs+TCO-HS组有最强的FITC-WGA荧光强度,说明EBP-Tz-FLs+TCO-HS可以较好地修复内皮糖萼。之后,运用FITC标记的白蛋白(FITC labelled bovine serum albumin,FITC-BSA)来检测该系统对HUVECs细胞通透性的影响,EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够较好地改善内皮细胞的通透性。最后,利用羧荧光素二乙酸酯-琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester,CFDA-SE)标记白细胞,考察白细胞对内皮细胞的粘附作用,试验发现EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够减少白细胞的粘附。在小鼠体内时,肺组织冰冻切片利用AF680标记的血小板-内皮细胞粘附分子抗体(AF680 labelled platelet endothelial cell adhesion molecule-1 antibody,AF680-CD31抗体)标记内皮血管,FITC-WGA标记糖萼,荧光成像看出,EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够修复肺内皮糖萼。进一步,考察证明EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够改善肺血管的渗透性。在急性肺损伤治疗作用的研究中,无论是离体肺组织水肿情况、肺湿干重比、肺组织匀浆液中TNF-α水平、肺组织H&E染色结果、急性肺损伤小鼠存活率,还是肺泡灌洗液中总蛋白浓度及细胞学分析,都表明EBP-Tz-FLs+TCO-HS具有良好的治疗急性肺损伤的能力。6.EBP-Tz-FLs和TCO-HS的体内外安全性EBP-Tz-FLs制剂无溶剂残留,EBP-Tz-FLs和TCO-HS的体外溶血百分率符合临床要求。三种材料:EBP-PEG-DMPE、Tz-DMPE以及TCO-HS,在0-160μg/m L的浓度时细胞存活率均大于70%。正常小鼠连续静脉注射EBP-Tz-FLs+TCO-HS四天,在整个给药周期中,小鼠体重无显著变化,各个脏器未见明显的病理学变化,血常规及生化指标都与生理盐水(Saline)组相似。以上结果表明EBP-Tz-FLs+TCO-HS的体内外安全性较高。研究结果显示,EBP修饰的膜融合脂质体可以实现良好的肺部靶向性,装载Tz的膜融合脂质体能够与TCO发生生物正交反应,进一步将HS靶向递送至糖萼受损的部位,起到更好地治疗效果。并且,EBP-Tsymbiotic bacteriaz-FLs+TCO-HS具有较好的安全性。这些结果表明,这种两步靶向递送系统可以有效增加HS修饰到糖萼受损部位的含量,可作为有效调节纳米载体体外和体内行为的有前景的工具。

花青素苷是草莓果实重要的营养物质,对果实色泽的形成至关重要。在我国,草莓主要在冬春季进行设施栽培,设施内光照不足导致草莓果实着色不良,商品性较低。因此,深入解析草莓果实发育与成熟过程中花青素苷代谢的调控机制对草莓果实品质形成至关重要。本研究新发现了两个WRKY转录因子—Fa WRKY44和Fa WRKY46,其均能影响草莓果实中花青素苷的积累,但其中的调控机制还不明确。因此,本研究采用生物信息学、qRT-PCR、过表达或沉默、转录组学和代谢组学、DAP-seq、酵母单/双杂交等技术手段探讨了Fa WRKY44和Fa WRKY46的表达特性及其调控草莓花青素苷代谢的机制。主要的研究内容和结果如下:1.采用PCR方法从两种二倍体野生草莓‘Ruegen’和‘五叶草莓’,两种八倍体栽培草莓‘红颜’和‘丰香’中分别扩增了Fa WRKY44和Fa WRKY46及其同源基因的CDS序列,结果显示WRKY44和WRKY46的CDS或氨基酸序列在这4种草莓中均相对保守。将Fa WRKY44或Fa WRKY46在烟草叶片中进行亚细胞定位,结果显示其蛋白均定位在细胞核中。将Fa WRKY44或Fa WRKY46连接在p ET-32a(+)或p GEX-4T-1原核表达载体上,使用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均能够诱导出可溶diABZI STING agonist浓度的目的蛋白。采用PCR方法从‘红颜’中扩增了Fa WRKY44和Fa WRKY46的启动子,序列分析显示Fa WRKY44的启动子序列(2131 bp)与森林草莓比较接近;Fa WRKY46存在两种启动子序列,其中promoter 1(2419 bp)与森林草莓中的更接近,promoter 2缺失了一段约700 bp的序列。2.采用qRT-PCR方法分析了Fa WRKY46和Fa WRKY44的组织特异性和在不同处理条件(低钾、干旱、低磷、ABA、高盐、低温和红蓝光)下的表达特性。结果表明,Fa WRKY46在‘红颜’草莓的根、茎、匍匐茎、幼叶、功能叶、花和不同发育时期的果实中呈现出强烈的组成型表达趋势,且表达水平极高;Fa WRKY44表现出比较弱的组成型表达趋势,在功能叶和花中相对较高,而在全红的果实中表达水平略低一些。Fa WRKY46对低磷、低温和高盐胁迫相对更敏感,Fa WRKY44则对低钾和低温更敏感。Fa WRKY46和Fa WRKY44均无法快速响应红光或蓝光处理。3.采用VIGS或瞬时过表达方法来改变Fa WRKY46或Fa WRKY44的表达水平。结果显示,在‘红颜’草莓果实中沉默Fa WRKY46或Fa WRKY44均能够抑制果肉中花青素苷的积累,在‘小白’草莓中过表达Fa WRKY46恢复了果肉中花青素苷的积累,但过表达Fa WRKY44则不能。采用qRT-PCR和RNA-seq方法进行了进一步分析,结果发现Fa WRKY46或Fa WRKY44对草莓果实花青素苷代谢的调控更有可能是通过影响花青素苷的转运、储存或降解(稳定性)等后期过程来实现的,而对花青素前期的合成及相关结构基因的影响有限。将Fa WRKY44在拟南芥中过表达后发现,其能够增加拟南芥野生型或3个ttg2突变体(CS2106724、SALK＿204777C、SALK＿206852C)的种子中原花青素的积累。4.采用qRT-PCR、HPLC、转录组学、靶向/类靶向代谢组学、DAP-seq等方法分析了调控‘红颜’和‘小白’草莓果肉的关键基因。结果表明,Fa MYB10或Fa TT19不是引起‘小白’草莓果肉中色素缺失的关键因素。苯丙烷生物合成途径中的Fa C4H对控制草莓果肉着色至关重要,其转录水平受抑制导致了‘小白’草莓果肉中无法积累花青素苷,且这种抑制不是由启动子序列甲基化引起的。Fa WRKY46通过调节Fa C4H的转录以及下游靶基因UFGT7、H~+-ATPase等来影响花青素苷的积累。5.采用酵母单杂交、酵母双杂交、Bi FC和生物信息学预测等方法筛选Fa WRKY44或Fa WRKY46的互作蛋白和上游调控基因。结果表明,Fa WRKY44Ascorbic acid biosynthesis与MBW复合体成员Fa TTG1、Fa EGL3或Fa LWD1-like之间存在蛋白互作,与Fa MYB1或Fa MYB10之间无互作。Fa WRKY46与Fa LWD1、Fa LWD1-like、Fa EGL3、Fa MYB9、Fa MYB10或Fa MYB11之间存在互作,与Fa MYB1、Fa MYB5之间无互作。此外,Fa WRKY44与PR1A、U-box 19、GL2、TT1、MYB59或ABC转运蛋白可能存在互作关系;Fa WRKY46与Nuclear transport factor 2、Dp-1转录因子、PP2C37、MAP3K1、PP2C23、PP2C4、ERF4、b HLH92、MYB39或ABI4等可能存在蛋白互作。Fa WRKY46的启动子能够被MYC2、b HLH13、NAC18、Zinc finger protein 1、WRKY3和FK506-binding protein 4-like结合。6.采用qRT-PCR和瞬时过表达等方法分析了MYBs、MAPKs和ABA信号通路基因对Fa WRKY44或Fa WRKY46转录水平的获悉更多影响。结果显示,草莓果肉中Fa WRKY44或Fa WRKY46的表达水平相对于果皮更容易受到Fa MYB5或Fa MYB10的调控。磷酸激酶Fa MAPK3、Fa MAPK4-2或Fa MAPK16能够影响草莓果肉中Fa WRKY44或Fa WRKY46的表达水平。ABA信号通路中的Fa NCED1、Fa Sn RK2.2或Fa Sn RK2.6对草莓果肉中Fa WRKY46的表达有促进作用,但对果肉中Fa WRKY44的转录则无明显影响。采用酵母双杂交和改进的双荧光素酶方法分析了Fa BT2蛋白对Fa WRKY44或Fa WRKY46蛋白水平的影响。结果表明,Fa BT2与Fa WRKY46或Fa WRKY44蛋白之间均无互作,但Fa BT2蛋白能够强烈的诱导Fa WRKY46蛋白的降解。