ALK抑制剂

结直肠癌(CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤,其发生、发展不仅与肿瘤细胞本身的特性有关,也与肿瘤微环境(TME)密切相关。作为TME的重要组成部分,肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)调节CRC中多种关键致癌过程,通过分泌细胞因子和趋化因子,并与炎症机制协调,促进肿瘤的发生、增殖和转移。基于TAMs对肿瘤进展的影响,目前靶向肿瘤巨噬细胞mitochondria biogenesis的相关治疗策略主要集中在将TAMs作为免疫治疗的靶点、抑制巨噬细胞募集、重新诱导TAMs的表型极化、将TAMs靶向治疗与常规治疗相结MRTX849体外合等方面。不仅如此,有研究指出将针对TAMs的靶向疗法互相结合,可能未来会成为治疗CRC联合疗法的重大突破,为临床CRC治疗提供更多选择。因此,对TAMs的功能和调节机制的日益了解将更有Panobinostat作用效探索它们在CRC中的临床应用。本文将对TAMs在CRC中发生、发展中的作用及相关机制进行综述,并总结了与TAMs相关的CRC潜在治疗策略,为CRC的诊治提供了新兴的思路和方法,具有参考价值。

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种危害严重的人畜共患病原菌，猪链球菌溶血素(suilysin, Sly)在猪链球菌的侵袭和致病中起关键作用，对多种类CP-456773核磁型的细胞具有毒性作用，但目前关于Sly的细胞毒性机制研究较少。为了探讨低浓度(0.3～0.6μg/mL) Sly诱导猪肾细胞PK-15(porcine kidney-15)的死亡方式，本研究首先采用原核表达并纯化获得重组猪链球菌溶血素(recombinant suilysin, rSly)，通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放检测rSly对PK-15细胞的毒性作用，并针对4种常见程序性细胞死亡方式，利用qPCR、间接免疫荧光、Werstern blot和流式细胞术对rSly作用于PK-15细胞12及24 h诱导的细胞死亡方式进行验证。结果显示，成功表达具有较高溶血活性(溶血单位为214)的rSly毒Fc-mediated protective effects素蛋白，确定其对PK-15细胞的毒性作用呈浓度依赖性，并且发现rSly作用PK-15细胞12和24 h均引起PK-15细胞凋亡相关基因—半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease 3, Caspase 3)、Caspase 9的转录水平显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率与r Sly浓度呈正相关，0.6μg/mL rSly作用PK-15细胞24 h，细胞凋亡率从9.35%增至49.9%；自噬关键基因—微管相关蛋白轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3β, LC3β)基因转录水平无明显变化且无自噬小体形成；焦亡关键基因—胃泌素D(gasdermin D,GSDMD)的转录水平无明显变化且GSDMD蛋白未发生明显切割AM-2282生产商；坏死性凋亡相关基因下调，且磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein, p-MLKL)表达水平受到抑制。上述结果提示低浓度rSly诱导PK-15细胞死亡的方式主要是凋亡。本研究丰富了Sly毒性作用的细胞模型，有助于揭示参加猪链球菌感染发展的分子机制。

CRISPR-Cas系统是原核生物的一种获得性免疫系统,用以抵御噬菌体的入侵。CRISPR-Cas系统依据Cas效应蛋白组成的不同可分为两大类,并进一步分为Ⅰ～Ⅵ六个类型。在这些类型中,Ⅲ型CRISPR-Cas系统因其复杂精密的免疫机制和对入侵者RNA以及DNA的切割而备受关注。Ⅲ型系统识别入侵的RNA分子作为靶标,并进一步分为Ⅲ-A到Ⅲ-F型。Ⅲ型系统的特征是在该基因座上有一个标志性的Cas10蛋白,它可以识别具有错配的protospacer侧翼序列(PFS)的目标RNA,一方面激活核酸酶结构域对非特异性单链DNA进行切割,另一方面产生相应的小分子作为第二信使激发下游的免疫反应。激GSK2118436抑制剂活的前提是:cr RNA的5’端重复区域(称为5’-tag)和target RNA(TR)序列两侧的3’端序列(称为3’anti-tag)是非互补的(称为同源TR,即CTR)。相反,如果这些侧翼序列是互补的(非同源TR,即NTR),则这两种活性都将受到抑制。但Ⅲ型中的Ⅲ-E亚型与常规的Ⅲ型系统存在很大的区别。在该系统中,4个Cas7结构域和一个小亚基(Cas11)融合成一个大的效应蛋白质,命名为g RAMP(giant repeat-associated mysterious protein),它能与caspase样的蛋白酶TPR-CHAT结合形成Craspase(CRISPR-guided caspase)复合物。然而,在本论文的研究之前,该蛋白酶活性还未被证实,Ⅲ-E型系统的免疫机制也仍然是未知的。本文围绕Candidatus“Scalindua brodae”的Ⅲ-E型CRISPR-Cas系统展开研究,首先解析了g RAMP-cr RNA的结构,结构中包含了上文所述的结构域和一个cr RNA分子,但是最后一个Cas7样结构域内的插入结构域(insertion domain)密度较低。对这一插入结构域的功能进行研究,pre-cr RNA的体外加工实验表明插入结构域可能参与了Sb-g RAMP对pre-cr RNA的加工过程。为了解g RAMP-cr RNA如何识别并切割target RNA,解析了g RAMP-cr RNA-TR的结构,在该结构中,TR与cr RNA互补配对形成异二聚体,Cas11结构域提供了一个带正电荷的表面来结合TR。通过对以上两个结构的分析以及体外RNA酶切实验的验证,确定了g RAMP中负责靶RNA位点1和位点2切割的具体氨基酸,即D547负责位点1的切割,D698/D806负责位点2的切割。为了寻找TPR-CHAT的潜在底物,测试了TPR-CHAT基因邻近的蛋白质,在g RAMP和TPR-CHAT所在的基因座上,通常有3个保守的附属基因,分别是csx30、csx31和编码sigma因子E的基因rpoE。体外蛋白酶切割实验证实,Craspase只有在CTR存在的情况下可以切割底物Csx30,但不能切割另外两个附属蛋白。通过质谱分析确定了切割Csx30的具体位点为L407。为研究Craspase的蛋白酶活性是如何由CTR而不是TR或NTR结合激活的,本文还解析了Craspase和Craspase与TR,CTR或NTR结合的复合物的结构。二者的区别是,NTR和CTR的3’anti-tag结合在Craspase的两个不同通道上,具有非互补3’anti-tag的CTR诱导了TPR-CHAT的构象变化,最显著的构象变化发生在TPR结构域的K321-N363区域,这种构象变化激活了TPR-CHAT的蛋白酶活性从而切割Csx30。为了进一Bone quality and biomechanics步研究Csx30切割的生物学意义以及Ⅲ-E型CRISPR-Cas系统的免疫机制,本文发现Csx30可以与Csx31以及Rpo E形成复合物,通过噬菌体侵染实验以及细菌生长曲线测定实验证实了,CTR激活的Csx30的切割触发了细菌的顿挫感染(Abi),并以此作为Ⅲ-E型CRISPR-Cas免疫系统的抗病毒策略。Ⅲselleck合成-E型系统是首个发现的偶联了蛋白酶的CRISPR-Cas免疫系统,展现出巨大的应用潜力。本文的研究为g RAMP的催化机制和Ⅲ-E型系统的免疫机制提供了重要的见解,为未来开发基于Ⅲ-E型系统的RNA编辑和检测工具奠定基础。

卵巢癌(Ovarian cancer,OV)发病隐匿、类型复杂、预后不良,严重威胁女性生命健康,晚期卵巢癌五年生存率仅为30%-40%。RNA剪接是一种重要的基因转录后修饰过程,通过去除前体mRNA(pre-mRNA)内含子(intron),保留外显子(exon),产生成熟的mRNA。选择性剪接(Alternative Splicing,AS)作为RNA剪接重要组成部分,可分为外显子跳跃(Skipped Exons,SE)、内含子保留、互斥外显子、可变5’剪接和可变3’剪接等5种类型,对于基因功能调控具有重要作用。相比于正常组织,肿瘤组织中RNA剪接事件数量增加30%以上。前体mRNA的异常剪接可促进肿瘤的发生发展、复发转移与耐药产生。然而,肿瘤中发生的异常剪接事件及其促癌机制,由于剪接方式的复杂性、发生可变剪接基因的多样性以及研究方法的局限性,仍远未阐明,值得深入探索。本论文聚焦于卵巢癌中多聚谷氨酰胺结合蛋白1(Polyglutamine binding protein 1,PQBP1)的作用,采用整合RNA组学的方法,全方位探讨其作为剪接因子促进肿瘤发生发展的作用机制,构建其调控的可medical costs变剪接基因网络,同时针对下游关键基因异常剪接,设计反义寡核苷酸药物,并研究其在肿瘤治疗中的应用。本论文主要由以下三个部分组成:第一章:PQBP1在卵巢癌中的表达、临床意义及对肿瘤恶性行为的影响。通过转录组、蛋白质组学测序,我们发现PQBP1在多种肿瘤中存在mRNA 水平与蛋白水平高表达。在卵巢癌中,约10%的患者存在PQBP1基因拷贝数扩增,且PQBP1高表达与高肿瘤突变负荷(Tumor mutation burden,TMB)正相关。随后,通过公共数据库与齐鲁医院标本库对其表达进行验证,并进行预后分析及单因素、多因素Cox回归分析,证明PQBP1高表达与卵巢癌分期、分级、大网膜转移、不良预后相关,PQBP1高表达与铂耐药是降低卵巢癌总生存期的独立风险因素。在上述研究的基础上,我们构建PQBP1敲低与过表达卵巢癌细胞系,并研究PQBP1对卵巢肿瘤细胞恶性生物学行为的影响。诱导性敲低PQBP1后,卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移能力降低,裸鼠皮下及腹腔成瘤能力明显下降,肿瘤重量、肿瘤生长速率均低于对照组,过表达PQBP1呈现相反的趋势。因此,体内外实验证实,PQBP1可发挥促癌基因的作用,促进肿瘤细胞增殖、侵袭及体内成瘤。第二章:PQBP1通过调控BAX 2号外显子跳跃抑制卵巢癌凋亡机制研究。我们进一步探究PQBP1作为剪接因子结合在pre-mRNA的偏好性及调控的可变剪接事件。利用二代测序RNA-seq及SpyCLIP-seq技术分析,PQBP1主要结合在基因外显子区及剪接位点附近,即外显子与内含子交界处,调控外显子跳跃。三代全长转录组测序Nanopore-seq与RIP-seq技术进行验证,得到同一结论。外显子内含子富集峰分析显示,敲低PQBP1后,外显子3’端内含子保留减少,外显子跳跃增加。且PQBP1通过与作用靶基因结合调控其表达,调控力度与结合峰丰度、数量与结合峰位置有关。KEGG通路分析显示,PQBP1直接结合且调控剪接的基因富集在细胞凋亡、RNA降解、RNA转运及mRNA监视等通路上。在PQBP1调控剪接且直接作用的靶基因中,我们聚焦于凋亡调控基因BAX(BCL2 Associated X),即BCL2家族中促凋亡基因的一员。其2号外显子跳跃会产生一种无义降解的短转录本(BAX-S)。而测序数据显示,PQBP1可通过直接结合BAX 2号外显子及1号内含子区域,促进2号外显子的跳跃,使全长BAX转录本(BAX-L)含量减少,BAX-S含量增加,从而降低BAX表达。Minigene,RIP-qPCR,RNA-pull down及RNA半衰期实验进一步验证该结论。TCGA,GSEA数据库及齐鲁医院标本分析发现,这种BAX基因的可变剪接产生的长短转录本在肿瘤与正常组织中存在差异表达,且BAX 2号外显子保留少的卵巢癌患者预后不良。随后,我们阐释了 PQBP1与线粒体凋亡的关系,在PQNSC 125973分子式BP1敲低细胞系中,早/晚期凋亡细胞比例均上升,ROS水平升高,线粒体膜电位降低且线粒体最大耗氧率降低。过表达PQBP1可以拯救BAX造成的卵巢癌细胞凋亡及细胞增殖能力的降低。综上,PQBP1通过调控IACS-10759价格BAX 2号外显子可变剪接及表达,抑制细胞凋亡,促进卵巢癌恶性进程。第三章:靶向BAX 2号外显子的反义寡核苷酸药物在卵巢癌治疗中的研究。我们利用第二章报道的PQBP1结合基序,在BAX 2号外显子附近设计3条反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotide,ASO),并用硫代磷酸酯键修饰以增加其稳定性,对肿瘤细胞进行处理。其中,ASO1可以改变BAX2号外显子剪接模式,并诱导细胞发生凋亡。随后,动物实验结果也证明了 ASO1对肿瘤细胞的杀伤作用。综上所述,本论文探究RNA结合蛋白PQBP1在卵巢癌中的作用机制,结论如下:1.PQBP1在卵巢癌中高表达且与不良预后相关;2.PQBP1过表达促进肿瘤细胞增殖、侵袭,抑制其凋亡;3.PQBP1主要结合在前体mRNA剪接位点附近的外显子及内含子处,其调控下游靶基因表达的能力与结合位点丰度、数目、结合位置显著相关;4.PQBP1过表达促进BAX第2号外显子跳跃,产生无义降解的短转录本,进而下调BAX表达,抑制卵巢癌细胞凋亡;5.靶向BAX第2号外显子剪接的反义寡核苷酸能够改变BAX剪接模式,从而诱导卵巢癌细胞凋亡。本研究为卵巢癌早期诊断提供了新的靶点,进一步探讨了基因异常可变剪接在肿瘤恶性生物学行为中发挥的作用机制,靶向剪接的反义寡核苷酸药物分子量小,合成便捷,在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。

N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuramiimmune recoverynic acid,NeuAc)是自然界中最常见的唾液酸(Sialic acids,SAs)家族成员,具有抗癌、抗病毒、促进神经系统和骨骼发育等多种生理功能,被广泛用作药物中间体和营养化学品。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为食品安全级模式菌株,遗传背景清晰,具有成熟的基因操作工具,是生产NeuAc的优良宿主。响应目标产物的生物传感器(biosensor)越来越多地应用于代谢工程改造中,通过筛选高效的途径酶突变体、平衡途径酶表达和合成异质性调控等提高目标产物的合成效率。目前B.subtilis中已报道的响应NeuAc的生物传感器动态范围有限、激活倍数较低,限制了高产NeuAc的酶突变体和B.subtilis重组菌株的筛选。本文首先构建了具有不同NeuAc转运能力的B.subtilis重组菌株,在此基础上设计并构建了可用于B.subtilis中高效响应NeuAc的生物传感器;随后在B.subtilis中引入NeuAc合成途径,并通过随机化N-乙酰神经氨酸合成酶Neu B的核糖体结合位点(RBS)和N-端编码序列(NCS)构建了突变体库,然后结合生物传感器和流式细胞仪,筛选获得了NeuAc产量提高的菌株,证明了构建的响应NeuAc的生物传感器可应用于高产NeuAc菌株的超高通量筛选。主要研究结果如下:(1)构建了具有不同NeuAc转运能力的B.subtilis菌株。首先验证了B.subtilis不具备将胞外NeuAc转运进胞内的能力,于是选取大肠杆菌(Escherichia coli)来源的NeuAc转运蛋白Nan C和NaGefitinib说明书n T,通过外源添加NeuAc的方式测试了它们转运胞外NeuAc的能力,进一步优化了Nan T的表达,从而获得了4株具有不同NeuAc转运能力的菌株BSP1、BSP2、BSP9和BSP7,作为宿主用于响应NeuAc生物传感器的构建。(2)构建了在B.subtilis中可高效响应NeuAc的生物传感器。首先将短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)来源Nan R的结合位点插入组成型启动子的不同位置,在不添加NeuAc的条件下筛选具有活性的杂合启动子;接下来引入Nan R,并利用具有不同NeuAc转运能力的B.subtilis选择能响应NeuAc的杂合启动子;最后通过优化Nan R表达量获得了一系列动态范围广、激活倍数高的生物传感器,其中P535-N2具有最广的动态范围,为180–20245 a.u.;P566-N2的激活倍数最高,可达122倍。(3)在B.subtilis中构建了NeuAc合成途径并成功应用生物传感器筛选获得NeuAc产量提高的枯草芽孢杆菌。首先通过启动子和5’UTR替换解除了BCompound C分子式.subtilis内源glm S的反馈抑制;然后引入脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)来源的neu C,敲除与6-磷酸葡萄糖胺(Glc N6P)分解代谢途径相关的基因nag BB、nag BA,最后以p P43NMK质粒为载体,游离表达E.coli来源的Econeu B,成功获得了NeuAc产量为2.02 g·L~(-1)的菌株。利用简并引物随机化p P43NMK质粒上Econeu B的RBS和NCS,构建了大小约为9×10~5的RBS和NCS文库;然后结合生物传感器P535-N2和流式细胞仪最终获得了4株有益突变体,其中BSNB3菌株的NeuAc产量达到3.07 g·L~(-1),较出发菌株提高了52%,证明了此生物传感器在指导枯草芽孢杆菌生产NeuAc中的适用性。

近年来,随着我国规模化养猪的快速发展,猪病毒病变得越来越复杂,老病未除,新病再发,疾病不断出现;病毒变异速度加快,并且绝大多数病毒病为免疫抑制性疾病,严重危害我国养猪业的健康发展。其中猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪流行性腹泻(PED)、猪伪狂犬病(PR)和猪圆环病毒病(PCVD)为规模化猪场常见病毒性疾病。为进一步了解近三年来山东省规模化猪场常见病毒病的流行情况,制定相应的防控措施,对山东各地区规模化猪场常见病毒病进行了病原学和血清学调查分析。2020-2022年本实验室从山东各地不同规模化猪场采集了2564份猪组织样品,通过聚合酶链式反应检测方法(PCR),对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)进行了病原学检测。2020-2022年从山东省各地不同规模化猪场采集血液样品4803份,通过酶联免疫吸附实验(ELISA),对CSFV-E2、PRRSV-N、PRV-g E和PCV2-Cap 4种病毒蛋白抗体水平进行了检测。检测结果显示,2020-2022年采集检测样品中CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PEDV病原阳性检出率分别为3.98%(38/954份)、19.97%(473/2368份)、2.35%(24/1023份)、20.93%(233/1113份)和39.32%(138/351份)。从病原检测情况看PCV2、PRRSV与PEDV检出率较高。血清学调查结果显示,2020-2022年检测样品中CSFV、PRRSV、PRV和PCV2的抗体阳性率分别为83.86%(3986/4753份)、82.05%(3858/4702份)、27.89%(1008/3614份)和95.96%(2924/3047份)。结合实验室长期以来对山东省常见病毒性传染病流行病学调查结果和文献报道,发现自非瘟爆发后,规模化猪场加强了生物安全管理体系建设,使山东省规模化猪场常见病毒病的阳性检测率呈逐年降低趋势,血清抗体水平也有所提升。本研究对32株PCV2分离株全基因组进行克隆测序发现,山东地区流行毒株以2.1d亚型为主,其次是2.1b和2.1e。分离株间基于ORF2基因的核苷酸和推导氨基酸同源性分别为90.7%-100%和85.4%-100%,与国内外其他参考毒株基于ORF2基因的核苷酸和推导氨基酸同源性分别为94.4%-100%和81.2%-100%。本研究对临床症状典型的PKampo medicineCV2感染猪只的病理学变化进行了剖检与镜检观察,剖检发现病猪全身淋巴结显著肿大,肾脏表面灰白色斑点,肺脏局灶性或弥漫性暗红色实变,肝小叶间质网格状增生,胃黏膜常见溃疡。取组织器官病料进行常规石蜡切片、HE染色,镜检可见全身多部位淋巴结淋巴细胞缺失、巨噬细胞增生;脾脏白髓淋巴细胞缺失;肾间质淋巴细胞、巨噬细胞灶状浸润增生;肺泡壁及小叶间质淋巴细胞浸润,并常继发卡他性化脓性肺炎;脑呈轻度病毒性脑炎病变。本研究还对12株PEDV分离株全基因组进行克隆测序Ferrostatin-1发现,山东地区流行毒株以G1型为主。分离株间之间核苷酸和推导氨基酸同源性分别为97.2%-99.9%和95.9%-99.7%,与国内外其他各型参考毒株基于ORF2基因的核苷酸和推导氨基酸同源性分别为93%-99.1%和90.9%-99.4%。综上所述,本研究进一步丰富了2020-2022年山东规模化猪场常见病毒病流行病学数据,比较分析了2020-2022年山东省猪常见病毒性传染病的流行趋势,分析了发生原因,并据检测BYL719说明书结果制定了相应的免疫防控措施。为山东省规模化猪场病毒病的科学精准防控提供参考数据,有利于山东养猪业的健康发展。

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病是最具毁灭性的水稻真菌病害,对水稻的安全生产造成极大威胁。自噬在稻瘟病菌侵染过程中发挥重要作用,因此,对稻瘟病菌自噬及其调控机理的研究已成为植物病理学研究领域的热点。先前的研究表明自噬与囊泡运输相偶联,除自噬相关基因(Autophagy-related genes,ATGs)参与自噬外,涉及囊泡运输的Rab蛋白也参与自噬过程。鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide-exchange factors,GEFs)调控Rab蛋白的活性。鉴于此,对稻瘟病菌MCC950 IC50中鸟嘌呤核苷酸交换因子的研究,有助于深入了解稻瘟病菌自噬过程。转运蛋白颗粒(Transport protein particle,TRAPP)复合体属于多亚基的栓系复合体,它是Rab蛋白的GEF。其中,酵母(Saccharomybiorational pest controlces cerevisiae)中TRAPP III复合体是Ypt1(Rab1同源蛋白)的GEF,其特异亚基Trs85在GEF功能和自噬中发挥重要作用,但Trs85同源蛋白在植物病原真菌中尚未报道。本文在稻瘟病菌中鉴定到Trs85的同源蛋白MoTrs85,利用RAD001同源重组技术获得Mo TRS85的缺失突变体ΔMotrs85,并对其进行表型分析发现缺失突变体ΔMotrs85导致稻瘟病菌生长速率降低、产孢减少、隔膜发育异常、附着胞形成率下降、糖原、脂质转移延迟、囊泡运输和内吞过程缺陷,以及致病力下降;进一步研究发现Mo TRS85参与调控Mo Ypt1的激活和稳定性,与野生型菌株相比,Mo TRS85缺失导致GFP-Mo Ypt1的荧光信号明显及其蛋白表达显著降低。为揭示MoTrs85调控稻瘟病菌生物学功能的分子机理,本文通过免疫沉淀结合质谱分析、生物信息分析和互作验证,发现Mo Snx41与MoTrs85互作。已有报道表明Mo Snx41参与内涵体转运和过氧化物酶体自噬,鉴于此,我们推测Mo Snx41与MoTrs85互作协同调控膜运输。总之,本研究结果揭示MoTrs85调控自噬介导稻瘟病菌致病的分子机制,为开发环境友好型杀菌剂提供理论依据和参考靶点。

三元基序家族蛋白7 (tripartite motif-containing protein 7, TRIM7)作为E3泛素连接酶TRIM家族的成员，在免疫调控、代谢等生理过程中发挥重要调控作用。此外，TRIM7的异常表达与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生发展密切相关并呈现出复杂的调控作用，但其在HCC中的表达调控机制尚不清楚。本研究首先利用多种在线数据库分析发现，TRIM7在HCC中高表达，并且TRIM7高表达的肝细胞癌患者预后较差；利用UCSC、JASPAR数据库分析预测TRIM7基因启动子区的转录因子结合位点。结果显示，TRIM7启动子上含有4个特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)转录因子结合位点。本研究利用双荧光素酶报告实验、ChIP-PCR方法检测发现，SP1通过直接结合在TRIM7启动子上的interface hepatitisSP1结合位点，从而正调控TRIM7启动子驱动的转录活性。RT-qPCR、Western印迹检测结果进一步显示，过表达SP1在mRNA和蛋白质水平均上调TRIM7基因的表达(P<0.01),且利用SP1抑制剂Mithramycin A处理能够逆转BaricitinibSP1对TRIM7基因表达的调控作用(P<0.0https://www.selleck.cn/products/carfilzomib-pr-171.html1)。总之，本研究初步揭示了TRIM7在肝细胞癌中高表达的调控机制，为深入研究该基因功能以及早期诊断、靶向治疗提供重要的理论依据。

背景和目的口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)是最常见的口腔癌组织学类型,在口腔癌组织分类中约90%的病例被归类为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),吸烟和饮酒是其主要危险致病因素,在世界范围内口腔鳞状细胞癌的患病率呈整体上升趋势,其患病群体趋于年轻化。在疾病的早期诊断相对容易,但不幸的是,大多数患者在诊断时已处于中期或者晚期。手术是治疗的首选方案,虽然手术治疗能够控制肿瘤的发展,但口腔颌面部血运丰富,解剖结构复杂,约1/3的患者接受常规的手术或放疗后仍会出现复发和远处转移而需要再治疗。中晚期患者一旦口腔鳞状细胞癌扩散转移,或侵袭重要解剖部位时便已失去手术治疗机会,姑息治疗就成为常见的治疗方案,但放疗影响大,化疗易耐药,预后较差,死亡率高达50%。因此,迫切需要我们进一步深入研究探讨口腔鳞状细胞癌的侵袭和转移的具体机制,这将对应对口腔鳞状细胞癌侵袭和迁移具有十分重要的意义。肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)在癌细胞的启动、进展和转移方面发挥着重要作用,最新的研究表明,调节肿瘤微环境的生化成分可能成为治疗肿瘤的一种新策略。分析肿瘤微环境中的生化组成成分时发现三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)是肿瘤微环境的主要生化成分之一,研究发现,在某些肿瘤中,ATP具有明显的促进肿瘤增殖、侵袭和迁移的作用。ATP作为一种重要肿瘤细胞外信号分子逐渐成为研究的热点。目前对ATP在肿瘤方面的研究主要集中在列腺癌、乳腺癌、直肠癌、膀胱癌等少数肿瘤,ATP作为信号分子是否具有普遍性需要进一步研究,ATP在OSCC中所发挥的细胞外分子的调控作用目前研究尚不明确。因此,本研究旨在探究ATP作为细胞外信号分子对OSCC细胞生物学行为的调控作用,并阐明其可能的作用机制,以期为OSCC肿瘤治疗提供新思路。材料与方法第一部分:评价ATP对OSCC细胞生物学行为的影响复苏 CAL27 和 SCC15 细胞系,以 0、50μM、100 μM、200μM 浓度的 ATP处理CAL27和SCC15细胞,CCK8实验、划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验,检测外源性ATP对OSCC细胞的增殖、侵袭和迁移的生物学行为的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中相关侵袭和迁移转录因子Snail、MMP2、MMP9、E-cadherin 和 Vimentin 的表达。第二部分:阐明ATP促进OSCC细胞侵袭和迁移与P2Y2-Src-EC59说明书GFR轴的关系2.1 OSCC癌组织中P2Y2、Src和EGFR的表达情况从UACAN中下载TCGA-HNSC数据库,筛选出520个OSCC样本和44个对照样本进行生物信息学分析,阐明P2Y2、Src和EGFR在OSCC组织和对照样本中的表达差异;从TIMER数据库分析P2Y2与Src和EGFR的相关性;从STRING数据库对P2Y2进行蛋白相互作用分析;Western 寻找更多blot和qRT-PCR实验方法检测OSCC组织中P2Y2、Src和EGFR的表达差异。2.2 OSCC细胞中P2Y2、Src、EGFR的表达情况采用Western blot和qRT-PCR检测ATP处理的OSCC细胞中P2Y2、Src和EGFR的表达差异。第三部分:探究ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴调控OSCC细胞侵袭和迁移的分子机制3.1 P2Y2参与ATP对OSCC细胞侵袭和迁移的调控作用使用siRNA敲低OSCC细胞中P2Y2的表达,采用Western blot和qRT-PCR检测转染效率,并筛选最优siRNA序列;使用划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验检测P2Y2敲低对OSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响;体内裸鼠成瘤实验检验P2Y2敲低对OSCC移植肿瘤生长情况的影响;qRT-PCR检测P2Y2敲低对OSCC细胞袭和迁移相关因子基因Snail、MMP2、MMP9、E-cadherin和Vimentin的表达变化。3.2 ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴促进OSCC细胞的侵袭和迁移Western blot检测P2Y2敲低对ATP诱导的OSCC细胞Src和EGFR的表达影响;Western blot检测Src抑制剂(Dasatinib)对ATP诱导的OSCC细胞EGFR表达的影响。3.3 PI3K/AKT信号通路参与外源性ATP调控OSCC细胞的侵袭和迁移利用TCGA数据库中口腔鳞状细胞癌的转录组数据,通过GSEA富集分析,探索P2Y2与PI3K/AKT信号通路的相关性;Western blot方法检测外源性ATP刺激OSCC细胞后PI3K和AKT表达影响;采用Western blot检测P2Y2敲低,对OSCC细胞中PI3K和AKT表达影响;采用Western blot检测分析抑制Src和EGFR表达后,ATP诱导OSCC细胞PI3K和AKT的表达情况;克隆形成实验、Transwell实验和划痕实验阐明PI3K和AKT抑制后ATP对OSCC细胞侵袭和迁移的影响。研究结果第一部分:ATP促进OSCC细胞增殖、侵袭和迁移CCK8实验结果表明,当ATP浓度为100 μM时OSCC细胞活力最强,选择100μUrinary tract infectionM浓度的ATP作为后续实验的浓度;细胞划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验分析显示外源性ATP促进OSCC细胞的侵袭和迁移;qRT-PCR检测发现OSCC细胞中侵袭和迁移相关因子基因Snail、MMP2、Vimentin和MMP9表达增加,E-cadherin表达降低。第二部分:ATP促进OSCC细胞侵袭和迁移与P2Y2-Src-EGFR轴密切相关2.1 OSCC癌组织中P2Y2、Src和EGFR的表达情况生物信息学结果显示:与癌旁的正常组织相比,Src和EGFR高表达于OSCC组织,且P2Y2的表达与Src和EGFR的表达高度相关;蛋白互作分析显示P2Y2、Src和EGFR蛋白之间也存在互作关系;Western blot和qRT-PCR实验结果表明:与癌旁的健康组织相比,P2Y2、Src和EGFR高表达于OSCC组织。2.2 OSCC细胞中P2Y2、Src、EGFR的表达情况Western blot和qRT-PCR实验结果表明;与正常口腔黏膜细胞相比,P2Y2、Src和EGFR在ATP处理OSCC细胞中高表达;P2Y2、Src和EGFR的升高具有剂量(0、50μM、100 μM、200μMATP)依赖性和时间(0、2 min、5min、10 min、20 min、30 min)依赖性。第三部分:ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴激活PI3K/AKT通路,促进OSCC细胞的侵袭和迁移3.1 P2Y2参与ATP对OSCC细胞侵袭和迁移的调控作用体外划痕实验、Transwell实验和克隆形成实验分析显示P2Y2敲低显著抑制OSCC细胞的增殖、侵袭和迁移;裸鼠成瘤实验结果显示P2Y2敲低可以显著抑制OSCC移植肿瘤的生长;qRT-PCR结果显示:P2Y2敲低导致OSCC细胞中侵袭和迁移相关因子基因Snail、MMP2、MMP9和Vimentin表达受到抑制,E-cadherin表达增强。3.2 ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴促进OSCC细胞的侵袭和迁移Western blot结果显示:与对照组相比P2Y2,敲低可减弱ATP诱导的OSCC细胞Src和EGFR的表达;Western blot结果显示:与正常对照组相比,Src抑制剂(Dasatinib)显著降低EGFR的表达。3.3 PI3K/AKT信号通路参与外源性ATP调控OSCC细胞的侵袭和迁移生物信息学结果显示:PI3K/AKT通路在高表达P2Y2的口腔鳞状细胞癌中被显著激活;Western blot结果显示:ATP刺激OSCC细胞后会导致p-PI3K和p-AKT表达升高;而P2Y2敲低导致p-PI3K和p-AKT的表达显著减少;抑制Src和EGFR表达导致p-PI3K和p-AKT的表达显著降低;克隆形成实验、Transwell实验和划痕实验显示,使用PI3K和AKT抑制剂会显著抑制ATP对OSCC细胞增殖、侵袭和迁移。结论1.外源性ATP激活P2Y2促进OSCC细胞增殖、侵袭和迁移。2.Src和EGFR的mRNA及蛋白在OSCC组织和细胞中均高表达,P2Y2-Src-EGFR轴激活PI3K/AKT通路促进OSCC细胞的侵袭和迁移。3.外源性ATP作为肿瘤微环境中的一种重要细胞外信号分子,在肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移过程中具有重要的作用。本研究表明,ATP通过P2Y2-Src-EGFR轴激活PI3K/AKT信号通路促进OSCC细胞的侵袭和迁移。

近年来,在新冠疫情肆虐的大背景下,青少年自杀事件愈加频繁,该群体的精神健康问题已不容忽视。而自杀与抑郁症之间有着密切关联,因此,了解青少年抑郁症干预的方法、探讨青少年抑郁和自杀之间的关联、研究自杀产生的危险因素,对于预防青少年抑郁、干预青少年自杀具有重要意义。本次翻译实践原文节选自《公共卫生视角下的抑郁症》的第九章、第十章和第十一章。节选内容通过一系列的研究成果,向读者介绍了青少年抑郁的干预方法、自杀的相关危险因素、以及青少年自杀和抑郁症的关系等,为青少年抑郁和自杀的预防研究提供了新的方向。通过本翻译,译者希望能够帮助医学领域的学者,掌握青少年抑郁Dibutyryl-cAMP NMR及青少年抑郁与自杀关系的研究现状,并Urologic oncology唤醒大众对青少年这一特殊群体心理健康的关注,为促进青少年群体的健康成长做出贡献。本翻译实践报告,共五部分。首先,本报告简要介绍了翻译实践的背景和意义,概述了原文本内容;其次,梳理了关联翻译理论的发展现状以及其三个核心概念,从译前、译中和译后三个阶段详细阐释了此次翻译实践的完整流程;在本报告的核心章节—案例分析中,以关联翻译理论为指导,以最佳关联为导向,译者选取实践中的经典案例,分析并总结了医学英语翻译在词汇、句子、语篇层面寻求最佳关联的方法和技巧。经分析译者认为,为了寻求译文与原文的最佳关联,使读者能够获得足够的语境效果,在词汇层面,根据术语类型可采取直译、意译和零翻译、词类转换等翻译技巧传达原作者的交际意图,而在句子层面,可采用增译、省译、拆分、句式重组等翻译技巧,使译文更加贴VP-16近读者的认知语境,更符合读者的阅读期待;在语篇层面,则需要译者根据中英文衔接手段的使用差异做出保留、省略和转换。最后,在翻译实践总结部分,总结了此次翻译实践的发现和不足。