ALK抑制剂

目的 研究当归Angelicae Sinensis Radix“解郁”功效与“活血”功效的相关性及机制。方法 采用慢性不可预见性温和应激（chronic unpredicted mild stress,CUMS）结合孤养复制大鼠抑郁模型，以行为学指标及血流变指标评价当归对CUMS大鼠抑郁样症状及血液黏度的调节作用，进行主成分分析和相关性分析量化抗抑郁指标和血流变指标间的相关性。应用1H-NMR代谢组学技术检测CUMS大鼠肝脏中内源性代谢物的变化，指认相关差异代谢物并构建代谢通路。结果 造模4周后，大鼠体质量、糖水偏爱率、旷场实验穿获悉更多越格数、直立次数均显著降低（P<0.01）severe alcoholic hepatitis，高、中、低切变率下的全血黏度均显著升高（P<0.01）。给予当归干预后，大鼠的行为学指标和血流变指标均有不同程度的改善。相关性分析结果显示，行为学综合指标与血流变综合指标呈显著负相关。代谢组学结果显示，在筛选得到的CX-5461价格19个潜在生物标志物中，当归能显著回调异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、柠檬酸等8种差异代谢物，涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成，乙醛酸和二羧酸代谢及甘油脂代谢等5条代谢通路。结论 当归的“解郁”功效与其“活血”功效存在显著相关性，其机制可能与调节氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢等代谢途径有关。

柑橘是我国第一大类水果,在脱贫攻坚中发挥了巨大贡献,已成为乡村振兴的抓手产业。柑橘黄龙病是全球柑橘生产上最具毁灭性的病害,是制约柑橘产业可持续发展的瓶颈。柑橘木虱作为柑橘黄龙病的主要虫媒,给我国柑橘产业带来了巨大影响。由于柑橘黄龙病没有直接有效的治理手段,所以柑橘intensive care medicine木虱的防控对柑橘产业的健康发展意义重大。目前,柑橘木虱的田间治理仍然依赖化学杀虫剂,但由于单一大量的用药,化学杀虫剂在实际应用中带来了各方面的隐患,如害虫抗性产生、环境污染、非靶标生物死亡、农产品残留超标等。在田间实际情况中,喷施杀虫剂后由于光照、雨水等非生物因素的影响,杀虫剂浓度通常会降低到不足以直接杀灭靶标害虫的低剂量,从而导致亚致死效应的形成。因此,探究亚致死效应是评估杀虫剂对害虫防效的的重要部分。本研究借助国家脐橙工Pevonedistat程技术研究中心平台,以柑橘木虱室内种群为研究对象,利用不同生测方法,探究了苯氧威和氟酰脲等两种昆虫生长调节剂对柑橘木虱未成熟发育阶段的室内毒力;基于毒力测定结果确定亚致死剂量,进一步系统比较了苯氧威和氟酰脲对柑橘木虱F_0代及F_1代的亚致死效应;在此基础上,利用转录组学技术,挖掘了柑橘木虱响应药剂亚致死胁迫的相关基因。主要研究结果如下:1昆虫生长调剂苯氧威和氟酰脲对柑橘木虱的毒力室内毒力测定结果显示,两种昆虫生长调节剂苯氧威和氟酰脲对柑橘木虱卵期及各龄期若虫都有较好的毒力。在浸渍法处理下,苯氧威对于柑橘木虱卵期毒力(LC_(50)值34.947 mg/L)高于氟酰脲(LC_(50)值52.343 mg/L)。在喷施法处理下,两种药剂对柑橘木虱不同龄期若虫都有一定毒力,苯氧威对于1龄若虫的毒力最强(LC_(50)值1.921 mg/L),随着龄期增加苯氧威毒力下降,对4龄若虫LC_(50)值为35.465 mg/L。同样,氟酰脲对于若虫的毒力随龄期增加而降低,其中,对1龄若虫和5龄若虫LC_(50)值分别为2.374和54.728 mg/L。在点滴法处理下,两种药剂对柑橘木虱5龄期若虫都具有一定毒力,但苯氧威毒力(LD_(30)值1.270 mg/L)显著低于氟酰脲(LD_(30)值0.586 mg/L)。2亚致死剂量昆虫生长调节剂对柑橘木虱生命表参数的影响采用微量滴度点滴法,分别利用苯氧威和氟酰脲不同亚致死剂量(LD_(10)和LD_(30))处理柑橘木虱后,F_0NSC 125973细胞培养代生命表参数均受到显著影响。与对照相比,药剂亚致死剂量处理后,柑橘木虱F_0代种群净增值率(R_0)与平均世代周期(T)均显著提高,内禀增长率(r_m)与周限增长率(λ)均降低,表明昆虫生长调节剂的亚致死剂量对柑橘木虱F_0代种群数量增长均有刺激作用。此外,苯氧威和氟酰脲的LD_(30)均显著延长柑橘木虱F_1代的若虫期,分别为16.43 d和18.11 d,但两种药剂LD_(10)对柑橘木虱F_1代若虫期均无显著影响。两种昆虫生长调节剂不同亚致死剂量分别处理后,柑橘木虱F_1代的生命表参数均受到显著影响。与对照相比,净增值率(R_0)和平均世代周期(T)均显著降低;内禀增长率(r_m)和周限增长率(λ)均显著升高,说明两种昆虫生长调节剂的亚致死剂量均有限延缓柑橘木虱F_1的种群增长。3柑橘木虱响应亚致死剂量昆虫生长调节剂胁迫的转录组分析利用高通量测序技术,构建获得柑橘木虱5龄若虫响应亚致死剂量昆虫生长调节剂(苯氧威LD_(30)和氟酰脲LD_(30))胁迫下的转录组文库。鉴于两种昆虫生长调节剂处理下柑橘木虱表现类似的亚致死效应,将两个文库联合分析,通过GO、COG和KEGG等数据库种对比分析,最终成功注释20,191条Unigene基因。分析出的差异表达基因共有3,173个,其中对照与氟酰脲处理间差异基因共2484个,上调1765个,下调719个,在COG数据库有484个得到注释,在GO数据库中有1445个得到注释,KEGG数据库有1193个得到注释;对照与苯氧威处理间差异基因共745个,上调448个,下调297个,在COG数据库有176个得到注释,在GO数据库中有498个得到注释,KEGG数据库有390个得到注释。在差异表达基因中,CYP450酶系相关基因40个,与GST酶系相关基因13个,与CCE酶系相关基因15个。

目前,放疗和化疗是临床癌症治疗的主要手段,但存在副作用大、治愈率低等问题,近年来一些新型的治疗方式如光热疗法、光动力疗法、化学动力学疗法等的研究备受关注。由于复杂肿瘤微环境具有固有的缺陷,单一治疗方式难以完全抑制肿瘤生长,而协同治疗可以克服单一疗法治疗效果不佳的问题,从而提高抗肿瘤治疗效果。纳米酶具有催化活性可控和稳定性良好等独特优点,因此被广泛应用于生物医学领域。因此,设计一类高效且多功能的纳米酶实现多种治疗方式的联合具有重要的研究意义。本论文主要设计合成了三种基于光热功能的纳米酶,研究了不同的酶活性、材料的光热性能以及协同肿瘤治疗效果。研究内容总结如下:(1)CuCoS纳米酶在光热治疗和化学动力学治疗中的应用。通过水热法合成了单分散的CuCoS纳米酶,该纳米酶不仅是一种优异的无机光热纳米材料,具有良好的光热转换性能,而且具有过氧化物酶活性和谷胱甘肽氧化物酶两种酶活性,可以催化肿瘤微环境中的H2O2产生活性氧并清除还原型谷胱甘肽,从而打破肿瘤细胞内氧化还原平衡。在近红外光808 nm照射下,温度的升高可以提高D-Lin-MC3-DMA浓度两种酶的活性以及酶反应速率,从而增加活性氧的积累,提高抗肿瘤效果。因此,CuCoS纳米酶可以实现光热疗法和温度增强的化学动力学协同疗法,显著抑制肿瘤增殖。(2)近红外可控触发细胞焦亡的诱导剂的设计及肿瘤免疫协同治疗。通过溶剂热法合成了均匀的介孔Pt纳米酶,进一步担载葡萄糖氧化酶(GOx)担载在介孔孔道中,材料外层进一步用热敏材料p(OEOMA-co-MEMA)(PCM)修饰获得纳米复合材料PCMPt/GOx。该材料具有以下优点:(ⅰ)热敏材料PCM可以防止GOx的提前泄漏,减少毒副作用,改善材料的生物相容性。(ⅱ)Pt纳米酶不仅具有良好的光热性能,实现近红外光可控的GOx精准、按需释放;而且Pt纳米酶具有类过氧化氢酶活性,可以消耗肿瘤微环境中的H2O2产生用于GOx催化反应所需要的O2并改善缺氧条件。(ⅲ)该复合材料可实现近红外光可控、热响应的细胞焦亡和免疫协同治疗。PCMPt/GOx作为一种近红外可控触发细胞焦亡的诱导剂,可以激活体内免疫反应,同时,温和光热可以逆转肿瘤免疫抑制微环境,与免疫治疗协同诱导细胞焦亡,具有良好的抗肿瘤效果。(3)超小Pt纳米酶在肿瘤化疗和光热治疗中的应用。通过水热法成功合成了粒径小于10 nm的超小Pt纳米酶,其光热性能良好,且具有类过氧化氢酶活性,能够与肿瘤微环境内的H2O2反应产生O2,改善乏氧条件。随后使用DSPE-PEG-NH2对材料进行表面修饰,使其可以成功负载β-拉帕酮(β-LAP)。在808 nm激Galunisertib IC50光照射后,光热引起的热休克蛋白表达增加和β-LAP可以同时激活醌氧化还原酶1,酶活性增加消耗细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸并产生H2O2,造成氧化损伤。Pt@β-LAP纳米颗粒通过协同光热疗法和bioactive molecules化疗抑制肿瘤增殖。

目的 将储存大于35 d的少白悬浮红细胞中纯化的红细胞微粒(RMP),与诱导极化THP-1巨噬细胞共培养，探究其对巨噬细胞极化的免疫调控作用。方法 通过离心结合超滤管方法分离RMP,经流式细胞术、透射电镜及粒径仪检测验证纯化得到的RMP;用PKH26标记RMPselleck化学后，采用激光共聚焦观察RMP进入巨噬细胞的情况；采用脂多糖(LPS)或白细胞介素4(IL-4)诱导THP获悉更多-1巨噬细胞极化并给予RMP处理，通过实时荧光定量PCR检测THP-1细胞M1型巨噬细胞标志分子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、 IL-6;M2型巨噬细胞标志分子IL-10、 CD163、 CD206的mRNA表达水平。结果 获得纯化的RMP, RMP可被巨噬细胞摄入，LPS诱导THP-1巨噬细胞M1极化，IL-4则诱导THP-1巨噬细胞M2极化，RMP处理后iNOS、 TNF-α、 IL-6、 CD206、 CD163、 IL-10表达均显著降低。结论 RMP抑制THlandscape geneticsP-1巨噬细胞的M1及M2型极化。

目的探析综合性心理护理对抑郁症患者的影响。方法于2022年1月～R428生产商2022年12月，将本院精神一科在此期间收治的150例抑郁症患者，按照随机数字表法将其分为两组：甲组（75例，常规护理干预）、乙组（75例，常规护理联合综合性心理护理），对比两组NN2211小鼠患者焦虑抑郁评分、生活质量评分以及治疗依从率。正态计量资料采用t检验，计数资料采用x~2检验。结果护理前，甲组和乙组抑郁症患者焦虑抑郁评分对比无显著差异（P>0.05）；经过护理干预后，患者焦虑、抑郁评分显著降低，且乙组评分显著低于甲组（P<0.05）；护理前，两组患者生活质量各项评分对比无显infection of a synthetic vascular graft著差异（P>0.05）；在护理后两组患者生活质量较之前显著提升（P<0.05），相较于甲组，乙组生活质量各维度的评分显著更高（P<0.05）；乙组治疗总依从率显著高于甲组（P<0.05）。结论综合性心理护理可以改善抑郁症患者的不良情绪，有利于提高其治疗依从性以及生活质量。

西藏环状病毒（Tibet orbivirus,TIBOV）是一种2009年新发Ceralasertib IC50现的环状病毒，它对家养动物具有潜在的危害。为了了解云南省西部边境地区芒市蠓虫中TIBOV流行情况，以及在TIBOV和Manglie virus(MaV)共感染情况下，MaV对TIBOV在细胞上增殖的影响。2018年7月我们在云南省德宏州芒市采集蠓虫标本，采用细胞进行病毒分离，获得2株阳性分离物，编号分别为MS18C217-8和MS18C217-9。MS18C217-8株阳性分离物接种C6/36细胞后72h出现细胞病变，细胞病变特点为圆缩、折光性变强和脱落等，而接种BHK-21细胞后168h没有出现明显细胞病变；MS18C217-9株阳性分离物接种BHK-21细胞后72h出现细胞变圆、脱落和破碎等细胞病变，接种C6/36细胞后168h没有出现明显细胞病变。分别采用虫媒病毒特异引物进行RT-PCNutrient addition bioassayR,MS18C217-9株阳性分离物TIBOV特异引物扩增阳性，而MS18C217-8株阳性分离物MaV特异引物扩增阳性。测序后，MS18C217-8获得1133个核苷酸序列，MS18C217-9获得1085个核苷酸序列。遗传进化分析结果显示，MS18C217-9株病毒与中国云南、广东、西藏等省、自治区和日本等地区分离的7株TIBOV位于同一进化分支，核苷酸同源性在93.1%～99.2%之间，提示MS18C217-9株病毒是TIBOV；而MS18C217-8株病毒与2011年和2018年云南分离的2株MaV位于同一进化分支，它们之间核苷酸同源性在96.9%～97.3%之间，提示MS18C217-8株病毒为MaV。TIBOV和MaV两种病毒在C6/36细胞上共感染研究结果显示，2种病毒共感染后TIBOV滴度低于TIBOV单独感染病毒滴度，提示MaV可能降低了共感染期间TIBOV复制。本研究首次在蠓虫中分离到MaV，并在同一地点采集的蠓虫中同时分离到了TIBOV和MaV，提示这两种病毒在当地的蠓虫中存在共流行。MaV在媒介中的感染可能会抑制TIBOV复制或传播。该研究结果不仅丰富了我国虫媒病毒种类资源，同时也为阻断动物虫媒病毒病的流行提Taurine配制供新的思路。

天然免疫系统是宿主抵御病原微生物入侵的第一道屏障。病毒感染细胞后,释放到胞内的病毒核酸作为一种病原体相Periprostethic joint infection关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)被宿主的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别,启始天然抗病毒免疫反应。当RNA病毒感染细胞后,胞内的病毒RNA被RIG-I/MDA5识别,进而被招募到位于线粒体上的接头蛋白VISA(virus-induced signaling adaptor)上并向下游传递信号。VISA通过激活IKKα/β/γ和TBK1/IKKε激酶进一步分别对转录因子NF-κB和IRF3进行磷酸化,导致其激活并转运进细胞核,诱导炎症细胞因子和I型干扰素的表达。当DNA病毒感染细胞后,胞内的病毒DNA被c GAS识别,诱导c GAS发生构象改变并催化第二信使c GAMP的合成。c GAMP结合并激活位于内质网上的接头蛋白MITA(mediator of IRF3 activation)。激活的MITA进一步招募激酶TBK1,介导IRF3发生磷酸化,导致IRF3激活并转运入核,诱导I型干扰素和下游效应蛋白的表达。最终,这些效应蛋白抑制病毒复制、清除被病毒感染的细胞、并激活适应性免疫应答。越来越多的证据显示机体代谢和免疫反应之间存在相互调节。然而,有关抗病毒天然免疫应答的体液代谢(包括激素和神经递质)调节机制的研究甚少。另外,研究表明宿主在压力或焦虑情况下会明显增加对病毒的易感性,但是潜在的机制尚不清楚。在生理情况下,急性应激主要通过激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis,HPA)和交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)诱导压力激素肾上腺素和去甲肾上腺素分泌,进而结合到细胞膜上肾上腺素能受体,通过激活下游不同激酶,调节机体的多种生物学过程。我们的研究发现,病毒感染下调血清中肾上腺素和去甲肾上腺素的含量,同时也明显下调免疫细胞上β-肾上腺素能受体ADRB1和ADRB2的水平。通过利用鼠源和人源免疫细胞,以及基因敲除小鼠,我们进一步发现,作为压力激素的肾上腺素和去甲肾上腺素以及它们的临床替代物异丙肾上腺素以ADRB1/2依赖的形式抑制宿主的抗病毒免疫反应。异丙肾上腺素处NVP-TNKS656小鼠理能够显著下调病毒感染诱导的干扰素的产生、以及小鼠脾脏和肺组织中下游抗病毒基因的表达,从而促进病毒在脾脏和脑组织中的复制,并导致小鼠对病毒诱导的死亡更加敏感。进一步的结果显NSC 125973示,肾上腺素和去甲肾上腺素通过ADRB1/2介导下游激酶PKA的激活,抑制病毒诱导的先天抗病毒反应。在细胞中敲掉PKACA/B可以阻碍异丙肾上腺素对病毒诱导的天然免疫反应的抑制效应。针对分子机制的研究表明,一方面,PKA催化VISA在T54位点发生磷酸化修饰从而抑制RNA病毒诱导的天然免疫反应;另一方面,PKA催化MITA在S241、S243和T263位点发生磷酸化修饰,削弱MITA与c GAMP的结合能力,从而抑制DNA病毒诱导的天然免疫反应。综合以上,我们的发现揭示了肾上腺素和去甲肾上腺素对先天抗病毒反应的负调控机制,并为压力或焦虑情况下宿主对病毒感染易感性增加提供了可能的解释。这项研究完善了我们对神经内分泌调控天然免疫应答的认知,为感染性疾病提供了新的治疗靶点。

目的 探讨基于阿片受体拮抗作用通过小剂量纳布啡对降低全身麻醉诱导期间快速预防舒芬太尼诱发呛咳的临床疗效。方法 选取2021年10月至2022年11月我院100例全身麻醉患者，采用随机数字表法分为纳布啡组INCB28060体内和常规组各50例。纳布啡组预先静脉注射纳布啡20μg/kg，常规组预注等容积生理盐水。10 s后两组患者均静脉注射舒芬太尼0.5μg/kg,1 min后给予其他诱导药物，肌肉松弛满意后行气管插管。比较两组患者全身麻醉诱导期间呛咳的发生率和程度；比较两组患者注射纳布啡或生理盐水前（T0）、注射纳布啡或生理盐水10 s后（T1）、注射舒芬太尼后1 min(T2)的平均动脉压（MAP）、心率（HR）和血germline genetic variants氧饱和度（SpO_2）；比较两组患者的不良反应。常规组发生呛咳27例，发生率为54.00%，显著高于纳布啡组，差异有统计学意义（P<0.05）；纳布啡组轻度、中度、重度呛咳发生率均显著低于常规组，差异有统计学意义（P<0.05）。结果 两组T0与T1时间点MAP、HR、SpO2水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；两组T2时间点MAP、HR水平Microbiology抑制剂均低于T1、T2时间点，差异有统计学意义（P<0.05）。两组不良反应率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 预注20μg/kg纳布啡能有效预防舒芬太尼全身麻醉诱导引起的呛咳，且对血流动力学无明显影响。

癌症是威胁人类健康的重大病症之一,其中乳腺癌居于女性恶性肿瘤发病率首位,如何高效治疗乳腺癌并且降低对患者身体的损伤是每位研究者所面临的难题。研究者不断深入对中药的认识,因此发现众多中药活性成分可用于肿瘤治疗,并且由于中药提取物为天然成分,使其具备毒副作用小的优势。但是,应用中药活性成分还面临不溶于水、代谢快以及易被清除等问题。于是临床上将中药抗肿瘤活性成分作为化疗药物联合使用或是放疗、手术等手段配合进行抗癌治疗,取得明显的治疗效果。基于纳米技术发展起来的多功能纳米平台可以装载中药活性成分,然后通过渗透和滞留增强(EPR)效应被动富集到肿瘤部位,改善中药活性成分的水溶性,实现体内长循环,从而提高抗肿瘤的效率,并且可以进一步的降低随机分散药物带来的毒副作用。现阶段已有研究将纳米材料与中药活性成分联系起来,期望实现体内长循环、靶向癌细胞、特定环境响应性等目的。因此我们设计了两种用于递送中药活性成分的功能化纳米药物递送体系,通过主动靶向癌细bioactive properties胞表面受体,从而富集在病灶肿瘤部位,并且具备肿瘤微环境刺激响应性能,可以有效将中药活性成分释放于癌细胞内,提高抗肿瘤活性,同时避免了其代谢快和易被清除的缺点。本论文基于光热纳米材料和铁基金属有机框架两种纳米载体,分别用于负载中药活性成分(青蒿琥酯/紫杉醇),结合铁死亡效应多途径治疗乳腺癌,以此设计了两种纳米制剂用于癌症的协同治疗。具体包括以下两个部分的工作:第一部分:基于青蒿琥酯的介孔聚多巴胺纳米递送系统的制备及抗乳腺癌应用研究。首先通过水热合成法制备得到介孔聚多巴胺(MPDA),并与氨基化聚乙二醇连接得到NH_2-PEG-MPDA,再连接转铁蛋白制备所得Tf-PEG-MPDA,随后共载中药活性成分青蒿琥酯(ART)和Nrf2抑制剂(ML385),最终得到纳米药物TPM@AM NPs。通过紫外、红外、高效液相、透射电子显微镜以及扫描电子显微镜等实验结果,验证ART和ML385的药物被成功装载,并通过计算得出青蒿琥酯和ML385的载药率分别为34.5%和2.9%。体外模拟不同生物环境的p H值,利用释药实验证明TPM@AM NPs可在酸性环境与光照条件下释放药物。随后我们通过体外细胞摄取实验发现TPM@AM NPs可被肿瘤细胞有效摄取。CCK8细胞存活率实验表明TPM@AM NPs在光照下具有最大的细胞毒性,细胞活性仅为28.1%;PCR、WB、MDA/GSH试剂盒等实验表明ART与ML385可通过抑制肿瘤细胞Nrf2通路以及下游相关抗氧化因子的表达,从而增强ART诱导肿瘤细胞发生铁死亡,提高抗肿瘤活性。选择以4T1乳腺癌肿瘤模型鼠为体内实验研究对象,荧光成像结果可说明给药6小时后肿瘤部位达到最大蓄积量,并且经光照肿瘤部位5分钟后可以升高肿瘤温度从而发挥光热治疗效果。最后通过给药治疗后能够有效抑制肿瘤体积生长,并且利用切片H&E染色技术,发现肿瘤组织被破坏。Nrf2和GPX4的免疫荧光结果告诉我们TPM@AM NPs可以有效诱导铁死亡的发生,利用小鼠体重、血常规以及血清检测实验结果证明TPM@AM NPs具有体内生物安全性。体内与体外结果共同说明TPM@AM NPs该纳米体系可以靶向肿瘤部位释放ART诱导铁死亡,ML385抑制肿瘤细胞抗氧化机制(Nrf2通路)而有效抑制癌细胞增殖,并联合光热治疗实现多途径治疗肿瘤,为ART的临床应用提供了一定的研究基础。第二部分:基于紫杉醇的金属有机框架纳米递送系统的制备及抗乳腺癌多药耐药研究。首先我们选择用三氯化铁和苯甲酸合成了一种GSH响应型金属有机框架MIL-100(Fe)作为药物载体,然后通过溶剂挥发法,共载紫杉醇(PTX)与FSP1抑制剂(i FSP1),最后在表面修饰氨基化聚乙二醇功能化透明质酸(NH_2-PEG-HA),获得HPM@Pi NPs。通过透射电子显微镜寻找更多、红外、紫外、高效液相、电BI 10773配制势变化、晶体衍射等实验方法验证了紫杉醇和FSP1的成功负载,并计算得出PTX和i FSP1的载药率分别为13.8%和2.3%。体外释药实验表明该HPM@Pi NPs具备GSH响应性。后续通过体外细胞实验,评估HPM@Pi NPs的靶向性,发现HPM@Pi NPs更容易被肿瘤细胞所内吞而不是正常细胞摄取,再选择以CCK-8试剂证明HPM@Pi NPs与其他纳米制剂相比具有最强的肿瘤细胞抑制率,可达75.6%。并且通过流式检测凋亡现象,证明通过纳米载体的装载能够使PTX更有效进入细胞从而发挥凋亡作用,而WB实验和GSH试剂盒实验结果也同时证明了铁死亡的发生,以此说明凋亡与铁死亡共同作用以实现抑制多药耐药乳腺癌细胞增殖。后续选择以裸鼠造模进行体内研究,荷瘤小鼠的体内荧光成像结果表明HPM@Pi NPs比没有HA修饰的纳米制剂更有效富集在肿瘤部位,并延长滞留时间。后续通过给药治疗实验发现HPM@Pi NPs能有效抑制肿瘤增长,并实现治疗耐药乳腺癌的目的,并且利用切片H&E染色技术,发现肿瘤组织被破坏,说明HPM@Pi NPs可以有效破坏肿瘤组织抑制其生长,最后利用小鼠体重、血常规以及血清检测实验结果证明HPM@Pi NPs具有体内生物安全性。体内与体外结果共同说明HPM@Pi NPs该纳米体系可以靶向肿瘤部位释放PTX,并联合i FSP1诱导铁死亡作用实现多途径治疗肿瘤,为PTX用于克服乳腺癌多药耐药提供了实验基础。通过两部分工作,成功构建了两种基于中药活性成分的纳米递药系统,其中第一个工作通过级联反应解决ART体内Fe~(2+)利用率不足问题,同时抑制Nrf2抗氧化作用,增强铁死亡从而高效抑制乳腺癌;第二个工作通过利用铁死亡提高耐药细胞对PTX的敏感度,为解决PTX的应用困境提出新的建议。两个工作内容均从体内外说明具有良好的抗癌效果和生物安全性,为中药活性成分应用开发提供了参考。

以孤雌生殖繁殖为主的竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)花芽雄化导致的大面积减产是产业发展急需解决的瓶颈问题。本课题组前期对雌雄花分化关键时期的转录组测序显著富集到细胞分裂素信号转导通路,发现细胞分裂素信号转导通路中的关键成员——细胞分裂素C类调控因子ZaARR24基因在竹叶花椒雄性花芽分化过程中表达量极高,而在雌性花芽中表达量极低,具有非常显著的特异性表达模式。因此,本研究从ZaARR24参与雌雄花分化的调控功能入手,对竹叶花椒雄花分化的内在原因进行解析。首先,结合课题组现有的转录组数据库,以汉源葡萄青椒为研究对象,运用RACE技术克隆ZaARR24的编码序列全长;利用在线生物信息学软件分析核酸和蛋白序列特征;构建荧光蛋白融合载体解析亚细胞定位情况。随后,通过模式植物拟南芥异源过表达和酵母双杂交技术明确ZaARR24调控雌雄蕊分化的基本功能和相互作用蛋白。最后,结合转录组测序、糖类物质和植物内源激素检测,以及6-BA外源处理解析ZaARR24可能涉及的遗传调控通路,从而初步阐明竹叶花椒ZaARR24RSL3溶解度参与雌雄花分化过程的分子机制和候选外源调控因子,为解决竹叶epigenetic drug target花椒花芽雄化问题提供丰富的数据支撑和技术参考。(1)结合RACE技术和参考基因组比对分析,本研究成功克隆ZaARR24基因编码序列全长,共编码125个氨基酸。与已公布的竹叶花椒基因组数据比较,本研究所获ZaARR24序列在第207 bp和第273 bp处存在碱基差异,但蛋白序列完全一致。生物信息学分析结果显示,ZaARR24蛋白序列与芸香科和大戟科亲缘关系相对较近,并在N端第20～120个氨基酸区域含有由3个Motif组成的REC保守结构域。此外,蛋白亚细胞定位结果表明,ZaARR24同时定位于细胞质和细胞核。(2)ZaARR24异源过表达株系的营养生长和生殖生长均受到显著抑制,出现了植株矮小、茎段木质部发育受阻、根系发育受阻等表型变化;同时,在生殖生长方面出现了抽薹和开花时间提前、花量明显减少、花器官整体缩小,果荚长度变短以及部分心皮发育不良等表型特征。此外,花粉活力和交互授粉结果表明,ZaARR24的过表达主要影响花粉发育和雌蕊胚珠的发育过程。(3)12种植物内源激素检测结果显示,ZaARR24过表达株系的细胞分裂素类物质含量整体提高,生长素和茉莉酸含量显著降低。此外,6种糖类物质分析结果表明,ZaARR24过表达显著提高了总糖、还原糖、海藻糖和蔗糖的含量,但淀粉和麦芽糖含量显著降低。同时,野生型和ZaARR24过表达株系花序芽的转录组差异分析结果显著富集于植物内源激素和糖类物质合成通路,且细胞分裂素信号以及淀粉和麦芽糖合成通路极显著下调。上述结果表明,ZaARR24可能通过影响细胞分裂素信号和糖类物质信号调控植物的生殖生长过程。(4)此外,ZaARR24蛋白无自毒和自激活现象。利用高通量酵母双杂筛库分析,共获得65个候选互作蛋白,主要涉及植物花芽性别分化、糖类物质代谢、植物激素信号转导等相关生物学过程。进一步的酵母双杂互作结果显示,ZaARR24与ZaAG存在蛋白相互作用,可用于后续蛋白互作情况分析。(5)结合上述分析结果,本研究进行了不同浓度6-BBelnacasanA处理纯雄株后相关基因的表达模式分析。结果表明,喷施100 mg/L浓度的6-BA对于雄花芽中ZaARR24的诱导效果最为明显,并显著降低了内源细胞分裂素信号转导通路基因的表达;而300mg/L的6-BA显著促进了雄花芽中细胞分裂素合成和信号转导以及淀粉和麦芽糖生物合成通路相关基因的表达水平。