ALK抑制剂

研究背景:抑郁症(Major Depressive Disorder,MDD)患者存在认知灵活性受损,本研究拟采用非情绪和情绪性任务转换范式测量MDD患者认知灵活性,阐明MDD患者是仅对情绪性信息存在认知灵活性受损,或是对所有信息(情绪性与非情绪性)均存在认知灵活性受损,并结合基于脑电微状态的溯源分析获得MDD患者在任务转换过程的时空变化和相应的脑功能状态,以进一步阐明MDD认知灵活性受损的电生理机制。方法:人口学资料相匹配的41名首发未服药MDD患者与42名健康对照(Health Control,HC)被试完成非情绪和情绪性两种任务转换范式,同步采集其行为学和脑电数据。采用2(组:MDD vs.HC)×2(范式:非情绪vs.情绪)×2(任务:重复vs.转换)重复测量方差分析比较两组在反应时和错误率上的差异。采用偏相关分析计算脑电微状态指标与行为学变量的相关性。采用全脑体素t检验比较两组基于微状态时间进程的标准化低分辨率电磁脑断层扫描(Standardized Low Resolution Brain Electromagnetic Tomography,s LORETA)图像的差异。结果:(1)与HC组相比,MDD组完成任务转换范式的错误率更高,反应时更长。(2)MDD组情绪性转换任务条件下的反应时与该条件的微状态2出现频率呈显著负相关(r=-0.44,p<0.01),与该条件的微状态2持续时间呈显著正相关(r=0.35,p<0.05);MDD组情绪性错误率转换成本与情绪性转换任务条件微状态3的全局场功率(r=-0.29,p=0.068)、出现频率(r=-0.30,p=0.052)和覆盖率(r=-0.31,p=0.055)均呈边缘显著负相关。(3)情绪性转换任务和情绪性重复任务的微状态2(在162-214毫秒时间窗内)s LORETA图像对比显示,MDD组在中央前回(Brodmann area 44;MNI coordinates:X=55,Y=10,Z=10)的激活程度显著高于HC组(t>selleck HPLC-4NN2211采购.859,p<0Medical geology.05);情绪性转换任务和情绪性重复任务的微状态3(在260-350毫秒时间窗内)s LORETA图像对比显示,MDD组在枕中回(Brodmann area 18;MNI coordinates:X=10,Y=-95,Z=10)的激活程度显著低于HC组(t>4.972,p<0.05)。结论:MDD患者对情绪与非情绪信息均存在认知灵活性受损,但对情绪性信息的受损更严重。在任务早期对目标信息异常的知觉控制可能是MDD患者认知灵活性受损的电生理机制。

河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是一种毒性极强的生物毒素,1909年被发现于河豚科的河豚种,经研究发现其作用机制为阻滞钠离子通道,从而阻断钠离购买E7080子内流,使得神经信号无法传导,致使动物感觉神经失能,四肢瘫痪、呼吸困难甚至死亡。但随着后续研究的深入,发现河豚毒素在低剂量时具有良好的镇痛、局麻、戒毒、抗肿瘤等多类功效。其中又以镇痛作用研究最为广泛深入。临床上已有使用河豚毒素与其他镇痛药联用的研究,效果表现良好。微球是一种新型的药物载体,是粒径在微米级的球形粒子,释药时具有明显的缓控释药特性。近年来微球的研究不断深入,越来越多样化的微球类型被开发出来,其制备工艺已相当成熟,微球形态及释放曲线等特性更可通过多种方法进行精准调控,微球已成为当前长缓控释制剂的重要载体。在微球制备材料中,可生物降解型材料一经发现就受到了广泛重视,由于其良好的生物相容性、可控的生物降解性能、对环境友好及成本可控等优点广受关注,其中聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)则是近年来的优秀代表,被美国、中国以及欧盟等地区国家认可,其在人体内完全降解生成对人体无害的二氧化碳和水,具有便于调控的释药速率及释放特性,是一种成熟可靠的微球制备材料。据此,本研究设计并制备了载河豚毒素的PLGA微球,研究内容主要分为以下几部分:首先,本文建立了水溶液及微球中河豚毒素的分析方法,综合尝试考察了反相离子对色谱法、亲水作用色谱法、ELISA试剂盒法及胶体金试剂盒法,最终确定反相离子对色谱法为检测最优解。该方法特异性良好,在1-20μg/m L范围内线性符合测定要求,线性回归方程为A=22216c+591.82(R~2=0.9999)。方法学验证结果证明该方法准确度与精密度均良好,RSD均小于2.0%。使用该方法考察了河豚毒素水溶液在37℃,100 rpm振荡条件下的稳定性,结果显示河豚毒素水溶液在该条件下极不稳定,28天降解约74.96±2.93%,为后续研究提供了数据支撑。其次,本文进行了河豚毒素-PLGA微球的处方筛选及表征。采用单因素考察法对微球处方制备工艺进行了最优处方筛选,确定微球最优处方为含5%Na Cl的0.5%PVA外水相,内水相为含100μg TTX的甲酸水溶液,油相为100 mg/m L PLGA的二氯甲烷相,内水相:外水相体积比=0.1:2.5,初乳搅拌速率为8000 rpm,初乳:外水相体积比=2.6:20,复乳搅拌速率为900 rpm。获得最优处方微球包封率为88.56±0.86%,载药量为0.036±0.001%,粒径为111±4.00μm,Span值为0.172。根据扫描电镜照片观察可知所制备微球表面圆整,体外释放特性拟合为一级释放模型,方程为ln(100-Y)=161.53367+0.05061t,相关系数为0.9628,微球14天释放接近90%,21天时浓度已低于方法检测下限。再次,本文进行了河豚毒素-PLGA微球的镇痛药效学考察。以Balb/c小鼠为实验对象,考察了河豚毒素水溶液的最大安全剂量,在此剂量下进行了后续实验考察。建立坐骨神经阻滞模型,以热缩足反射潜伏期(TWL)和机械刺激缩足反射阈值(MWT)为考察指标,采用热板法进行各种制剂作用下小鼠、大鼠的热缩足反射潜伏期(TWL)变化,采用Von Frey纤维丝法考察大鼠的机械刺激缩足反射阈值(MWT)变化,小鼠组热板法结果表明,生理盐水组小鼠前后爪TWL与基础比较并无统计学差异。吗啡水溶液组在0.17 h左右开始起效,小鼠前爪TWL与基础出现显著性差异,后爪TWL增加至大于60 s,0.5 h时到达顶峰,前后爪TWL均增加至超过60 s,然而https://www.selleck.cn/products/Puromycin-2HCl.html持续时间较短,2-4 h效果开始衰退,至8 h时恢复至与基础相近水平。河豚毒素水溶液在0.15 h时发挥最强镇痛效果,小鼠前爪TWL由15.32±8.49 s增加到59.43±0.84 s,后爪TWL由21.30±8.85 s增加到55.48±9.03 s,表明河豚毒素水溶液对热板所致的小鼠疼痛有显著的抑制作用,但同样镇痛时间较短,2-4 h效果开始减弱。8h时恢复至基础水平。河豚毒素-PLGA微球组小鼠在给药后,前爪TWL与基础TWL相比变化无统计学差异,而后爪的TWL在2 h时提高至53.21±8.59 s,且在2 h至14天内均保持在较高水平,与基础TWL存在显著差异,在17天时后爪TWL恢复至基础水平,表明药物在2h开始起效,且作用时间长达14天,说明河豚毒素-PLGA微球主要在后爪给药部位发挥局部镇痛作用。说明在此期间对小鼠有显著抑制热痛效果。在大鼠坐骨神经阻滞模型中,热板法测定不同组别热缩足反射潜伏期变化与小鼠表现一致且差异性更为明显,生理盐水组和空白微球组TWL与基础水平无统计学差异,舔前爪TWL为5.17±1.29 s,舔后爪TWL为5.98±1.08 s,吗啡水溶液在0.5 h作用达到顶峰,前爪TWL为7.54±2.66 s,后爪TWL为10.41±1.76 s,前爪与后爪TWL与基础均存在显著性差异,河豚毒素水溶液同样在0.5 h到达顶峰,前爪TWL为7.26±1.01 s,后爪TWL为10.88±1.22 s,与基础相比出现极显著差异,河豚毒素-PLGA微球组前爪TWL在全时间段内与基础无统计学差异,后爪TWL在1 h时开始与基础出现统计学差异,达到8.08±2.00 s,且在1 h至14天内均保持在较高水平,17天检测时后爪TWL恢复至5.41±0.37 s,Von Frey纤维丝法测定结果显示,生理盐水及空白微球对大鼠机械刺激缩足反射阈值无影响,MWT为26 g,吗啡组给药后大鼠后足的机械刺激缩足反射阈值均明显提高,左右后足反应相同,1h时达到最高阈值180 g,2 h后开始下降,在1 d后完全恢复至空白水平,河豚毒素水溶液与吗啡组大鼠阈值变化趋势相同,1h时达到最高阈值180 g,随后开始下降,在1d后完全恢复至空白水平,载药微球组给药后在1 h时左右后足出现差异,左爪作为对照侧阈值无明显变化,而给药侧的右后足阈值开始出现差异性上升,1 h时出现统计学差异,并持续12天,随后开始下降至空白组水平。说明河豚毒素-PLGA微球主要在后爪给药部位发挥局部镇痛作用,具有明显延长河豚毒素镇痛效果的作用。最后,本文建立了生物样本中的河豚毒素含量测定方法,考察了以大鼠为实验对象的河豚毒素水溶液在尾静脉和坐骨神经处给药和河豚毒素-PLGA微球在坐骨神经处给药的药代动力学参数。使用检测方法为LC-MS/MS,采用ESI正离子源,选择甲苯磺丁脲为内标物,河豚毒素和甲苯磺丁脲的检测离子对分别为320.1→301.9(m/z)和271→171.7(m/z),含量测定方法特异性良好,大鼠血浆中的内源性物质与内标物对河豚毒素的检测均无干扰,在1-200 ng/m L浓度范围内线性良好,线性回归方程为Y=0.008338X-0.001664,R~2=0.9991,定量下限(LLOQ)为1 ng/m L,具有良好的准确度和精密度,基质效应和提取回收率良好,可作为河豚毒素在大鼠血浆中的检测方法。使用该检测方法测定河豚毒素水溶液在尾静脉及坐骨神经处和河豚毒素微球在坐骨神经处给药的药时曲线并计算得到药代动力学参数,结果显示,尾静脉注射河豚毒素水溶液半衰期约为19.76±6.58 h,坐骨神经处注射后河豚毒素半衰期为30.38±12.93 h,河豚毒素-PLGA微球坐骨神经处注射河豚毒素半衰期为390.70±137.79 h,河豚毒素微球在给药后检测到河豚毒素浓度在21天内均处于较低浓度,高于检测限但低于或接近最低定量下限。比较坐骨神经处给药TTX水溶液(61.24±12.95 ng/m L*h)与微球组(641.70±169.18 ng/m L*h)的AUC_(0-∞),发现微球组AUC_(0-∞)是TTX水溶液的10倍,但实际给药量为TTX水溶stem cell biology液的40倍,结合河豚毒素-PLGA微球发挥局部镇痛作用来看,可以初步判断河豚毒素-PLGA微球给予大鼠后,释放的河豚毒素集中于局部给药部位。综合结果表明河豚毒素-PLGA微球发挥药效时不存在全身毒性,全血中浓度始终保持在安全剂量范围内。总之,本研究初步证明了所制备的河豚毒素-PLGA微球具有良好的缓释特性,药效学考察实验证明其切实延长了河豚毒素的作用时间,在保证其处于安全浓度范围内发挥了较好的长效镇痛作用。对长效镇痛药的开发和拓展具有一定的指导意义。

茶园土壤是温室气体氧化亚氮(Nitrous oxide,N_2O)排放的重要来源,且茶园土壤中施肥诱导的N_2O排放系数远大于旱地农田。为了提高茶叶的产量和质量,茶农往往会投入大量氮肥。然而,过量施用氮肥必然会增加茶园土壤N_2O排放,因此如何减少茶园N_2O排放对茶园来说至关重要。原花青素作为一种生物反硝化抑制剂(Biological inhibition of denitrification,BDI),可以提高土壤中氮的可利用性,从而促进植物生长,并减少土壤中N_2O的排放。但是,原花青素对强酸性茶园土壤中N_2O排放及反硝化作用的影响还未见报道。因此,本文从全球茶园土壤N_2O排放数据分析开始,探究茶园土壤N_2O排放的相关影响因素,并结合实验探究BDI影响茶园土壤N_2O排放的原因,通过室内培养实验和田间原位观测试验相结合,探究了BDI添加对茶园土壤N_2O排放量变化规律,结合土壤理化性质的差异及相关功能基因的丰度,解析BDI对茶园土壤N_2O排放的影响,旨在明确茶园土壤N_2O排放及原花青素添加后减排的内在原因,为茶园的合理、健康、可持续绿色发展提供理论和现实依据。主要结论如下:(1)施肥使茶园土壤N_2O排放量增加了584%。肥料对N_2O排放的刺激作用主要是由于较高的N肥投入。与化肥相比,有机肥、复合肥、生物炭和抑制剂分别减少了63%、64%、69%和94%的N_2O排放。在全球范围内,施肥使全球茶园N_2O排放量增加4Ponto-medullary junction infraction4.5Gg N yr~(-1),抑制剂的添加使N_2O排放量减少了14.0Gg N yr~(-1)。(2)在室内培养实验中,测试原花青素添加对土壤理化性质和N_2O减排效应。为此设计一个为期21天的室内微Ceralasertib供应商宇宙培养实验,实验分为三个处理组:对照组(CK)、肥料处理组(N)、肥料和原花青素添加组(NI)。结果显示,原花青素添加后茶园土壤N_2O排放总量为53.90 nmol g~(-1)显著低于未添加原花青素处理组N_2O排放的总量(62.27 nmol g~(-1)),添加原花青素后减少了大约18%的N_2O排放。茶园土壤N_2O的产生与土壤有机碳(Soil organic carbon,SOC)、NH_4~+含量、微生物生物量碳(Microbial biomass carbon,MBC)和反硝化相关基因密切相关。原花青素可以显著降低nir S和nir K反硝化基因的丰度,显著增加nos Z反硝化基因的丰度从而使茶园土壤的N_2O排放总量减少。(3)在宁波市三山茶园建立田间原位观测试验,同室内培养实验设计相同,同为三个处理组。常规施肥(N)处理N_ICI 464742O排放总量为10.56 kg N·ha~(-1),常规施肥与原花青素联用处理组(NI)的N_2O排放总量为7.94 kg N·ha~(-1),原花青素添加后减少了24.74%N_2O排放。原花青素主要通过增加了土壤SOC含量,降低土壤亚硝酸还原酶活性来抑制茶园土壤N_2O排放。同时,添加原花青素显著减少了nir K基因的丰度,显著增加了nos Z基因的丰度,原花青素在强酸性土壤中对土壤N_2O的还原作用增强。综上所述,本研究揭示了原花青素添加后茶园土壤N_2O产生的生物以及非生物驱动因子,追踪减少N_2O排放的生物学以及非生物学影响因素。而原花青素可以作为一种良好的土壤改良剂,具有减少茶园土壤N_2O的排放的潜力。

目的:探讨稀土氯化镧对卵巢癌细胞(人COC1细胞系、人卵巢癌SKOV3细胞系)及卵巢癌顺铂耐药细胞(COC1/DDP细胞系、SKOV3/DDP细胞系)的作用以及蛋白表达的机制。方法:1、选择人卵巢癌(COC1)细胞株、人卵巢癌耐顺铂细胞株(COC1/DDP)、人卵巢癌(SKOV3)细胞株作为实验细胞株,并通过将SKOV3培养于含有DDP的培养液中并逐步增加DDP的浓度使其产生耐药性,获得SKOV3/DDP耐药细胞株。2、采用0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μmol/L浓度的氯化镧分别进行CPost infectious renal scarringOC1细胞系及COC1/DDP细胞系的常规培养及添加半数已知浓度顺铂的联合培养,于48h后,利用MTT法进行各组细胞增殖抑制率的检测。3、按照加入氯化镧浓度不同将COC1和COC1/DDP细胞分别分为对照组(细胞悬液+培养基)、低剂量组(0.5μmol/L氯化镧)、中剂量组(2μmol/L氯化镧)和高剂量组(5μmol/L氯化镧),加入氯化镧培养48h后,在透射电子显微镜下观察不同浓度氯化镧处理后COC1和COC1/DDP细胞形态变化。4、依据细胞处理方法,将COC1和COC1/DDP细胞分别分为对照组(COC1或COC1/DDP)、顺铂组(COC1或COC1/DDP+DDP)、氯化镧组(COC1或COC1/DDP+氯化镧)和顺铂+氯化镧组(COC1或COC1/DDP+DDP+氯化镧),利用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,以Western blot检测不同处理方式下COC1/DDP细胞中ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl蛋白的相对表达量。5、采用DDP浓度逐渐增加的方法诱导卵巢癌DDP耐药细胞株(SKOV3/DDP),并在显微镜下观察其形态变化。6、向SKOV3和SKOV3/DDP细胞加入浓度分别为1、2、4、6、8、10、20、30μg/m L的DDP,培养24小时后,采用CCK8分析DDP对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的生长抑制率(Cell growth inhibition rate,GIR)和耐药指数(RI)。7、向SKOV3/DDP细胞中分别加入浓度为5、10、20、40、60、80、160、320μg/m L的氯化镧,培养36、48小时后采用CCK方法分析不同浓度不同时间药物对细胞生长抑制率。8、依据细胞处理方式不同将SKOV3和SKOV3/DDP细胞分为对照组(SKOV3或SKOV3/DDP)、氯化镧组(SKINCB28060 MWOV3或SKOV3/DDP+10μg/m L氯化镧)、DDP组(SKOV3或SKOV3/DDP+5μg/m L DDP)和氯化镧+DDP组(SKOV3或SKOV3/DDP+5μg/m L DDP+10μg/m L氯化镧)。将细胞处理后置于培养箱中培养7d计算不同实验组细胞克隆数。利用流式细胞术检测各组SKOV3和SKOV3/DDP细胞的凋亡率,以Western blot检测不同处理方式下SKOV3/DDP细胞中ERCC1、Ki67、CDK6、c-Cbl和Caspase-3蛋白的相对表达量。结果:1、顺铂处理后COC1及COC1/DDP细胞的增殖率明显降低,且呈现出浓度依赖性。COC1细胞株的IC50为2.11μg/m L,COC1/DDP细胞株的IC50为22.86μg/m L,耐药指数为10.53倍。2、MTT检测细胞增殖率的结果显示:氯化镧对COC1细胞及COC1/DDP细胞的生长具有显著的抑制作用,并呈现出浓度依赖特征。氯化镧以1.5μmol/L为节点,低于该浓度则细胞增殖的抑制效果降低;超过该浓度则细胞增殖的抑制效果增强,并呈现浓度依赖特征。取1.5μmol/L浓度的氯化镧进行卵巢癌细胞的处理,可获得最优的细胞增敏效果。3、对照组和低剂量组的COC1和COC1/DDP细胞形态正常,核膜完整,细胞器和细胞核结构清晰,胞内无空泡,两组间细胞形态的差异不显著(P>0.05)。中剂量组的COC1和COC1/DDP细胞株均出现微量皱缩,胞质内有少量空泡。高剂量组的COC1和COC1/DDP细胞株染色质固缩后凝结成团块,分布无规律,边界不清,形成新月状或环状小体在核膜周边聚集,而后细胞浆浓缩,内质网变疏松并与胞膜融合,形成空泡;细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体,细胞凋亡较多。4、对照组、顺铂组、氯化镧组、顺铂+氯化镧组的COC1细胞及COC1/DDP细胞的凋亡率分别为5.52±0.92%及4.60±1.11%、25.40±4.38%及18.24±2.81%、7.22±2.55%及5.59±1.73%、27.54±4.03%及29.12±5.38%.与对照组相比,顺铂组、顺铂+氯化镧组COC1/DDP细胞中ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl蛋白表达水平明显降低(P<0.01);与顺铂组相比,顺铂+氯化镧组COC1/DDP细胞中ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。5、SKOV3细胞株呈鹅卵石样,形态规则,DDP诱导后的SKOV3/DDP细胞株呈长形梭形,相对扁平。6、采用相同浓度DDP处理SKOV3和SKOV3/DDP细胞株,DDP对SKOV3细胞抑制率明显高于SKOV3/DD(P<0.05)。DDP对SKOV3细胞的半数抑制浓度IC50为4.54μg/m L,对SKOV3/DDP细胞的IC50为11.12μg/m L,SKOV3/DDP对DDP的耐药指数(RI)为2.45。7、当氯化镧浓度低于40μg/m L时,氯化镧对SKOV3/DDP细胞株作用36h和48h时的细胞生长抑制率相比无统计学差异(P>0.05),当氯化镧浓度≥40μg/m L时,相同Fer-1小鼠浓度氯化镧对SKOV3/DDP细胞株作用48h时的细胞生长抑制率明显高于36h(P<0.05)。8、与对照组相比,氯化镧组、DDP组和氯化镧+DDP组的细胞克隆形成率均明显下降。氯化镧组的细胞克隆形成率与对照组相比具有统计学差异(P<0.05);DDP组的细胞克隆形成率与对照组相比具有显著性差异(P<0.01);氯化镧+DDP组的细胞克隆形成率与对照组相比具有极显著性差异(P<0.001)。氯化镧+DDP组的细胞克隆形成率明显低于DDP组(P<0.01)。9、与对照组相比,氯化镧组、DDP组和氯化镧+DDP组的SKOV3/DDP细胞凋亡率明显上升。氯化镧组的SKOV3/DDP细胞凋亡率与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。DDP组和DDP+氯化镧组的SKOV3/DDP细胞凋亡率均较对照组升高(P<0.05),而且DDP+氯化镧组的SKOV3/DDP细胞凋亡率高于DDP组(P<0.05)。与对照组相比,DDP组和氯化镧+DDP组中的ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl蛋白表达量明显下降(P<0.05);DDP组和氯化镧+DDP组中的ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl蛋白表达量明显低于氯化镧组(P<0.05);氯化镧+DDP组中的ERCC1、Ki67、CDK6和c-Cbl蛋白表达量低于DDP组(P<0.05)。与对照组相比,氯化镧组、DDP组和氯化镧+DDP组中的Caspase-3蛋白表达量明显上升(P<0.05);DDP组和氯化镧+DDP组中的Caspase-3蛋白表达量明显高于氯化镧组(P<0.05);氯化镧+DDP组中的Caspase-3蛋白表达量高于DDP组(P<0.05)。结论:1、低浓度氯化镧对卵巢癌COC1、COC1/DDP、SKOV3和SKOV3/DDP细胞生长均无显著抑制作用;2、氯化镧与顺铂共培养时可显著增强顺铂对卵巢癌细胞的抑制增殖作用,并促进卵巢癌细胞凋亡作用;3、氯化镧可显著下调SKOV3/DDP细胞中ERCC1蛋白表达,使得ERCC1基因的DNA修复功能受到阻碍,从而导致SKOV3/DDP细胞Caspase-3蛋白表达活化增加,加快细胞凋亡。4、氯化镧提高卵巢癌细胞对顺铂敏感性的潜在机制可能与ERCC1、Ki67、CDK6及c-Cbl蛋白表达下调以及Caspase-3上调有关。综上所述,本研究为氯化镧作为抗癌药物的临床应用提供实验依据。但仍需要进一步的研究来揭示参与氯化镧和顺铂协同作用的机制。

波里马细胞质雄性不育系(pol CMS)是我国油菜杂交制种中最为普遍应用的雄性不育系,其中波里马细胞质温敏雄性不育系(pol TCMS)作为两系育种的典范具有育性受温度控制的性状。该不育系在低温16℃环境下恢复部分育性,在高温24℃环境下则表现为完全不育,然而波里马细胞质温敏不育的关键基因和分子机制尚不清楚。本研究利用已报导的4个拟南芥温度感受器基因(At PHYB、At PIF4、At ELF3和At ARP6)对温敏不育进行研究,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制了相关温度感受器基因的突变体。本研究主要结果如下:1.甘蓝型油菜pol TCMS 596温敏表型分析。甘蓝型油菜pol TCMS在开花期之前进行低温16℃预培养,进入开花期后进行不同时间梯度的高温24℃诱导,结果显示,导致pol TCMS彻底不育的高温诱导时间须达到40 min。将低温16℃预培养的材料转入高温24℃培养时,对不同大小的花蕾进行形态学标记并观察各花蕾开花后的育性,观察结果显示pol TCMS 596小于1 mm的花蕾经高温诱导后表现为彻底雄性不育。2.温度感受器基因的生物信息学分析。对温度感受器基因进行基因家族成员鉴定发现,从甘蓝型油菜ZS11基因组中鉴定出11个Bna PHYs、23个Bna PIFs、14个Bna ELFs和28个Bnmedial plantar artery pseudoaneurysma ARPs;筛选了Bna PHYB、Bna PIF4、Bna ELF3和Bna ARP6的同源基因各为4个、5个、4个和3个同源拷贝;进化分析发现,Bna PHYB、Bna PIF4、Bna ELF3和Bna ARP6分别与At PHYB、At PIF4、At ELF3和At ARP6高度同源。3.温度感受器基因的组织表达模式分析。在甘蓝型油菜ZS11中,Bna PHYB在茎和花蕾中表达量较高,Bna PIF4在茎和花瓣中表达量较高,Bna ELF3在茎中特异表达,Bna ARP6在各组织均有表达。不同温度处理后的RNA-seq数据显示,高温诱导相对于低温诱导,pol TCMSTezacaftor纯度花蕾中Bna PHYB、Bna ELF3和Bna ARP6表达量升高,Bna PIF4表达量降低;低温诱导(16℃)下,Bna PHYB、Bna ELF3和Bna ARP6表达量在pol TCMS中显著低于pol CMS中的表达,Bna PIF4在pol TCMS中的表达显著高于pol CMS中的表达。4.通过CRISPR/Cas9敲除转基因实验创造了敲除Bna PHYB、Bna PIF4、Bna ELF3和Bna ARP6的突变体,T_0代共获得91株单基因突变体单株,其中phyb突变体31株,pif4突变体为20株,elf3突变体为15株,aselleck合成rp6突变体为14株,对T_0代CRISPR/Cas9阳性植物进行编辑检测,Bna PHYB、Bna PIF4、Bna ELF3和Bna ARP6的编辑效率分别为92.31%、66.67%、55.56%和58.82%。不同的编辑类型及其平均效率为:插入(50.22%)、缺失(16.09%)、置换(0.82%)、复杂突变(32.87%),同时,在单碱基突变方面,A/T碱基对的突变概率>C/G碱基对的突变概率。5.突变体表型考察。在低温16℃培养下,phyb突变体的育性与野生型pol TCMS596有差异,phyb突变体表现为花丝伸长受阻,花粉量显著较少,花瓣缩小。对其它农艺性状进行观察,结果显示phyb突变体生长过程中表现为叶片缩小,分枝数显著减少。综上所述,推测Bna PHYB影响甘蓝型油菜株型发育,可能参与调节pol TCMS在低温下的育性恢复。本研究中其他基因的突变体未观察到育性变化,其功能有待进一步研究。

目的 总结SYNGAP1基因相关常染色体显性智immunoaffinity clean-up力障碍5型患3-MA核磁儿临床表型及遗传学特点。方法 回顾性分析中南大学湘雅医院儿科诊治的8例SYNGAP1基因相关智力障碍患儿的临床资料。结果 8例患儿的平均起病年龄为9月龄，均伴有中重度发育迟缓（语言落后为著），其中7例患儿伴癫痫发作。8例患儿中7例为新发杂合变异（3例移码变异、2例无义变异和2例错义变异），1例为6p21.3微缺失。目前已报道的中国SYNGAP1基因变异相关智力障碍患儿（包括该研究）有48例，其中40例伴癫痫发作，癫痫发作平均起病年龄为31.4月龄，多为移码变异（15/48,31%）和无义变异（19/48,40%）。治疗上，有癫痫用药史记录的33例患儿中，丙戊酸抗癫痫发作治疗对多数患儿有效（85%,28/33），其中4Belumosudil化学结构8%(16/33)患儿丙戊酸单药或联合用药治疗达到发作完全控制。结论 SYNGAP1基因相关常染色体显性智力障碍5型患儿起病年龄早，多数患儿伴癫痫发作，以移码变异和无义变异为主，丙戊酸抗癫痫发作治疗对多数患儿有效。[中国当代儿科杂志，2023,25 (5):489-496]

背景围产期抑郁症受到越来越多的关注。然而,对抑郁症的网络结构的详细研究仍然缺乏。本研究的目的是从网络的角度来研究爱丁堡产后抑郁量表(EPDS)和患者健康问卷(PHQ-9)之间的异同。方法于2020年8月-2022年3月进行横断面研究。研究按照流行病学观察性研究报告进行撰文。研究共招募了2484名孕妇。所有参与者都完成了EPDS和PHQ-9量表的评估。主要使用网络分析方法进行Tamoxifen纯度统计分析,并构建了两个网络模型:EPDS模型和PHQ-9模型。结果使用EPDS和PHQ-9量表进行产前抑郁检出率分别为3PUN301190.2%和28.2%。在EPDS量表网络结构中,EPDS第8条目”悲伤或痛苦”节点(强度=1.2161)是最中心的节点,而EPDS第10条目”自残”节点(强度=0.4360)是最小的中心节点。在PHQ-9量表网络结构中,第4条目”疲劳”节点(强度=0.9815)是最中心的节点,而第9条目”自杀”是最小的中心症状(强度=0.5667)。对于这两种模型来说,”悲伤”都是一个重要的中心症状。结论心理症状在EPDS量表评估抑郁症时可能更重要,而身体症状在PHQ-9量表评估抑郁症时可能更有影响力。对于EPDS和PHQ-9量表来说,”悲伤”都是一个重要的中心症状,这表明它可能是未来进一步的母亲抑Risque infectieux郁干预的最重要的目标。

背景:肺结核(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的传染病,是单一感染源致死的第二大病因,近年来,耐药结核分枝杆菌的出现和传播进一步增加了结核病的防治难度。此外,结核病的治疗周期长、患者服从性差,加剧了耐药结核病的发展。因此,抗结核新靶点的发现、新药物的开发以及抗结核策略优化对于结核病的诊疗至关重要。我国拥有丰富的中医药资源和悠久的中医药文化,积累了丰富的用药知识,临床使用十分普遍。随着中医药研究的深入,其作用机制日渐清晰。天然产物来源广泛,包括中草药、动物和微生物来源的化学成分或其代谢物,结构丰富,药理作用众多,使其在临床药物开发中脱颖而出。本研究从三个重要抗结核靶标酶入手,构建酶活性抑制剂高通量、可视化荧光筛选体系,期望从天然产物中发掘新的抗结核药物,优化治疗方案。N-乙酰转移酶2(N-acetyltransferase,NAT2)可以将一线抗结核药物异烟肼代谢为乙酰异烟肼,在Mtb中参与分枝菌酸的合成和异烟肼的代谢失活。将NAT2作为抗结核靶点,建立一种NAT2活性高通量、可视化的检测方法,筛选天然产物来源的抑制剂。既可以通过抑制分枝菌Tezacaftor纯度酸的合成发挥抗菌作用,又可以减少异烟肼的代谢失活,通过联合用药增强抗结核的效果。β-内酰胺酶(β-lactamase,Blac)是结核分枝杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的根本原因,它可以破坏抗生素的β-内酰胺环,使其失去抗菌作用。通过荧光可视化酶活性筛选平台评价Blac的天然来源抑制剂,逆转结核分枝杆菌对β-内酰胺类抗生素的天然耐药性,探究抗结核治疗新方案。硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸组成,是Mtb中重要的抗氧化系统,在维持生物体内的氧化还原平衡、DNA合成和氧化防御等生理过程中发挥重要作用。TrxR是可信的抗结核靶点,利用荧光探针分子快速筛选天然产物中TrxR的小分子抑制剂,发掘潜在的抗结核化合物。综上所述,开发肺结核靶标酶活性的高通量、可视化荧光检测方法,构建天然产物与靶标酶相互作用的评价体系,发掘潜在的抗结核活性成分,开发新型抗结核策略,为肺结核的治疗提供高内涵分子工具。第一部分N-乙酰转移酶2荧光可视化分析及中药抑制剂筛选在抗肺结核中的潜在应用目的:设计、开发用于检测NAT2活性的off-on型荧光探针,表征探针的荧光属性,评价探针的荧光成像功能,探究中药与NAT2的相互作用规律,考察NAT2天然抑制剂的抗菌效果,以及与抗结核药物异烟肼联合使用的抗结核效果。方法:(1)以氟硼二吡咯(4,4-difluoro-boradiazaindacene,BODIPY)为荧光团,引入苯胺作为NAT2的识别基团和荧光猝灭基团,开发检测NAT2的特异性荧光探针BDPN;(2)对探针BDPN荧光属性进行表征,建立NAT2活性评价体系;(3)利用探针BDPN对结核分枝杆菌内源性NAT2进行可视化成像检测;(4)利用探针BDPN高通量筛选对NAT2有抑制作用的中草药,以活性追踪方式对活性成分进行分离,通过扫描电镜和透射电镜观察活性成分对Mtb细胞壁的影响,考察体外抑菌活性;(5)考察活性成分与抗结核药物异烟肼联合使用时对异烟肼代谢失活过程的影响,以及联合用药对抗结核药效的影响。结果:(1)荧光探针BDPN在498 nm具有明显的吸收峰,荧光强度较弱,经NAT2催化后,在512 nm处产生明显的荧光信号,说明BDPN可以作为检测NAT2活性的off-on型荧光探针;(2)通过化学计算阐释探针及其代谢产物在激发态的电子分布,进一步说明BDPN作为检测NAT2活性的off-on型荧光探针的机理;(3)BDPN在多种生物介质中具有较好的稳定性和专一性,在多种化学抑制剂中,只有NAT2的选择性抑制剂槲皮素可以阻断乙酰化反应,分子对接结果进一步验证了BDPN对NAT2的特异性,说明BDPN可用于复杂生物integrated bio-behavioral surveillance样本中选择性检测NAT2的活性;(4)借助BDPN对Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155的内源性NAT2进行共聚焦成像,BDPN在NAT2催化下产生明显的荧光信号;(5)借助BDPN的优越性能,从168种中草药中筛选出对NAT2抑制活性最强的中药补骨脂,并分离得到四个抑制作用较强的活性单体,其中,异补骨脂查尔酮具有较强的抗菌作用,能显著抑制BDPN在Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155中的荧光信号;(6)扫描电镜和透射电镜实验表明,经异补骨脂查尔酮处理的Mtb H37Ra细菌形态明显改变,细胞壁完整度被破坏,轮廓不清;(7)异补骨脂查尔酮可以抑制Mtb H37Ra生长速度,减缓异烟肼的代谢失活速率,从而增加药物浓度,提高异烟肼在Mtb H37Ra中的抗结核效果。结论:(1)通过体外代谢评价,明确了BDPN可用作复杂生物体系中检测NAT2的高选择性off-on型荧光探针;(2)实现Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155内源性NAT2的可视化检测;(3)通过高通量、可视化筛选和活性示踪方法,分离鉴定强效抑制剂异补骨脂查尔酮,可以影响Mtb H37Ra细胞壁的形成,改变细菌形态,抑制Mtb的生长;(4)异补骨脂查尔酮能够减缓异烟肼的代谢失活,增强抗结核效果。综上所述,BDPN为潜在抗结核药物的发掘、新抗结核策略的实施提供实用型分子工具。第二部分荧光高通量筛选β-内酰胺酶抑制剂改善肺结核的抗生素治疗策略目的:设计、开发用于检测β-内酰胺酶(β-lactamase,Blac)活性的近红外荧光探针,表征探针的荧光属性,评价探针的荧光成像功能,探究中草药与Blac的相互作用,与β-内酰胺类抗生素联合使用缓解Mtb的天然耐药性,达到抗结核目的。方法:(1)以半菁为荧光团,引入β-内酰胺环作为识别位点,开发Blac的特异性荧光探针LXMB;(2)通过化学计算阐释荧光机理;(3)表征探针LXMB的荧光属性,建立Blac活性评价体系;(4)通过分子对接阐释LXMB与Blac间的相互作用;(5)高通量筛选对Blac有抑制作用的中草药,在荧光示踪指示下对活性成分进行分离,通过分子对接阐释活性成分与Blac的互作规律;(6)利用探针LXMB的成像功能对Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155内源性Blac进行可视化检测;(7)考察Blac抑制剂与β-内酰胺类抗生素联合使用时对Mtb H37Ra的抑菌效果。结果:(1)荧光探针LXMB在588 nm处具有明显的吸收峰,且自身荧光较弱,经Blac催化后,在700 nm处产生新的吸收峰,在724 nm处观察到明显的荧光信号,说明LXMB可以作为检测Blac活性的off-on型荧光探针;(2)化学计算阐明该探针的荧光机理,进一步说明LXMB是一种检测Blac活性的off-on型近红外荧光探针;(3)LXMB在多种内源性物质中表现出优异的稳定性,且120 min内具有良好的光稳定性;检测Blac具有较广的线性区间,化学抑制和单酶归属实验均表明其在多种生物酶中对Blac表现出优异的选择性,分子对接实验进一步阐释了LXMB对Blac高选择性和良好亲和力的原因,说明LXMB可以用于复杂生物样本中Blac的活性检测;(4)从260种中草药中筛选出对Blac具有强烈抑制作用的五倍子,在活性示踪下分离得到活性成分单宁酸;(5)单宁酸抑制Blac的IC_(50)为1.003μM,利用分子对接分析单宁酸与Blac的作用机制;(6)在共聚焦成像实验中,LXMB在内源性Blac催化下产生明显的荧光信号,抑制剂单宁酸可以减弱荧光信号的产生,能够观察到巨噬细胞吞噬LXMB标记的Mtb H37Ra,说明LXMB在成像方面具有优良性能;(7)单宁酸可以增强多种β-内酰胺类抗生素的抗结核效果。结论:(1)代谢显型、化学计算和分子对接实验表明,LXMB可用作复杂生物体系中检测Blac的特异性off-on型近红外荧光探针;(2)LXMB可以实现Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155内源性Blac的可视化检测,并对巨噬细胞内被标记的Mtb H37Ra进行荧光示踪;(3)LXMB用于高通量筛选Blac抑制剂,单宁酸可以联合β-内酰胺类抗生素,显著增强抗结核效果。因此,LXMB可用于分析Mtb对β-内酰胺类抗生素的耐药机制,也为Blac抑制剂的开发提供高内涵的荧光分子工具,从而提高β-内酰胺类抗生素的抗结核效果。第三部分硫氧还蛋白还原酶荧光探针的开发及天然产物中潜在抗结核药物筛选目的:设计、开发用于检测硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)活性的近红外荧光探针,表征探针的荧光属性,评价探针的荧光成像功能,探究中草药和天然产物与TrxR的相互作用,评价活性成分的抗结核效果。方法:(1)以1,3-二氯-7氨基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAN)为荧光团,引入二硫键作为识别位点,开发检测TrxR的特异性荧光探针DDAT;(2)表征探针DDAT的荧光属性,建立TrxR活性评价体系,并通过分子对接解析DDAT与TrxR的相互作用;(3)高通量筛选对TrxR有抑制作用的中草药和天然产物,在活性示踪下对活性成分进行分离鉴定,通过分子对接分析活性成分与TrxR间的相互作用;(4)利用探针DDAT的成像功能,对Mtb H37Ra内源性TrxR进行可视化分析;(5)刃天青显色法测定巴西苏木素、胶霉毒素对Mtb H37Ra的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),并考察胶霉毒素对Mtb H37Ra生长速度的影响,通过碘化丙啶渗透实验和扫描电镜观察胶霉毒素对Mtb H37Ra的形态结构影响。结果:(1)荧光探针DDAT在TrxR的催化下生成DDAN,吸收峰发生红移,在610 nm生成新的吸收峰,并在666 nm处荧光GSK2118436化学结构信号显著增强,说明DDAT可以作为检测TrxR的off-on型近红外荧光探针;(2)DDAT在p H 3.0-9.0范围内具有稳定的荧光强度,在多种内源性物质中表现出优异的稳定性,在多种生物酶中对TrxR表现出高度的选择性,荧光强度的变化与TrxR浓度呈良好的线性关系,通过化学抑制实验进一步证明DDAT对TrxR的专一性,通过分子对接实验分析了DDAT与TrxR的相互作用,说明DDAT具有优异的稳定性和选择性,可以用于复杂生物样本中TrxR的活性检测;(3)从260种中草药和180种天然产物中筛选出对TrxR具有强烈抑制作用的苏木和胶霉毒素,在活性示踪下分离得到活性成分巴西苏木素,通过分子对接实验分析了巴西苏木素和胶霉毒素与TrxR的相互作用;(4)借助DDAT对Mtb H37Ra的内源性TrxR进行共聚焦成像,DDAT在TrxR催化下产生明显的荧光信号,抑制剂Ebselen和胶霉毒素可以减弱荧光信号;(5)巴西苏木素和胶霉毒素对Mtb H37Ra具有显著抑制作用,破坏Mtb H37Ra细胞壁的完整性,改变菌体形态。结论:(1)代谢显型和分子对接实验确证DDAT可用作复杂生物体系中检测TrxR的高选择性近红外荧光探针;(2)DDAT可以实现Mtb H37Ra内源性TrxR的可视化检测;(3)DDAT用于高通量筛选TrxR抑制剂,发挥抗结核作用。DDAT可用于分析Mtb中TrxR活性,为筛选TrxR特异性抑制剂、新型抗结核药物的开发提供实用的荧光分子工具。

艰难梭菌(Clostridioides difficile)是医院和社区抗生素相关性腹泻的主要致病菌,其广泛存在于人的肠道、动物体内、居住区以及自然环境中,并且已从肉制Carcinoma hepatocelular品、海鲜、蔬菜等食品中分离检出。艰难梭菌可在人、食物和环境之间传播,当抗生素治疗破坏固有肠道菌群后,食物或环境中的芽孢可经口摄入,在肠道中萌发并大量繁殖,造成艰难梭菌感染(CDI)。CDI可导致宿主出现腹泻、假膜性结肠炎和巨结肠等艰难梭菌相关性疾病(CDAD),是一种世界范围的高致病率和高死亡率的卫生保健问题,老人及住院病人极易感染。艰难梭菌的高致病性主要来自于它所产生的三种外毒素,即毒素A(Tcd A)、毒素B(TcdB)和艰难梭菌转移酶毒素(CDT)。其中TcdB被认为是最主要的毒力因素。自1978年首次报道艰难梭菌感染与抗生素滥用相关以来,研究人员对大量临床相关菌株进行了分离鉴定,其中许多菌株被发现含有一些突变的TcdB。根据其序列突变TcdB被分为8个亚型或者变体。在本研究中,表达并纯化了来自艰难梭菌的8个TcdB亚型,检测了它们与不同受体结合的能力,并对表达于主流菌株中的优势型(TcdB1、TcdB2、TcdB3和TcdB4)做了结构与机理上的功能分析及病理表型验证。通过在不同受体基因敲除细胞上的验证,本课题组发现这些亚型在已知受体硫酸软骨素多糖4(CSPTalazoparib核磁G4)和卷曲家族蛋白(FZDs,主要是FZD1/2/7)的选择上具有高度的多样性:TcdB1结合两种已知受体CSPG4和FZDs蛋白,TcdB2选择性地结合CSPG4,TcdB3更容易结合FZDs,而TcdB4既不结合CSPG4也几乎不结合FZDs。本研究通过构建TcdB1与TcdB3嵌合的蛋白及后续功能验证,确定了N端半胱氨酸蛋PLX4032白酶结构域(CPD)中的区域参与CSPG4的识别。再通过系统设计的突变筛选以及在TcdB1和TcdB3之间切换残基,找到了TcdB-CPD与CSPG4相互作用的关键氨基酸残基(G624,G626)。结合已报道的TcdB在C端与CSPG4结合的关键氨基酸残基,本课题组发现这些位点虽然分布在多个不相邻的结构域,但它们在空间位置上相互靠近,形成一个交汇的功能区域。进一步用小鼠直肠内灌注模型评估TcdB1～4引起的病理表型,结果显示TcdB1导致的总体症状最严重,其次是TcdB2和TcdB3。当比较TcdB2和TcdB3引起的病理表型时,TcdB2引起更强的水肿,而TcdB3引起更严重的炎症细胞浸润。这些发现共同证明了流行株TcdB亚型结合受体的偏向选择性,并进一步导致它们的结肠病理表型差异。本研究主要探讨了TcdB四种主要流行的亚型在宿主受体识别和病理诱导方面的差异,确定了影响不同亚型结合受体能力的关键结构域以及关键氨基酸残基,提示TcdB亚型之间与受体结合选择性的差异与CDAD的发病机制有关。因此本研究为艰难梭菌毒素变体的毒理学和病理学提供了新的见解,这对开发食品中艰难梭菌的检测方法及艰难梭菌感染有效的治疗手段至关重要。

目的 探讨心肺运动测试(CPET)过程中血压下降冠心病患者预后的相关因素。方法 选取北部战区总医院自2016年2月至2020年1月收治的5 036例进行CPET的冠心病患者为研究对象。根据是否发生主要不良心血管事件(MACE)将患者分为A组(发生MACE,n=1 730)与B组(未发生MACE,n=343)。比较两组患者的临床资料、化验和介入相关情况、心肺功能。采用多因素Logistic回归分析检验CPET过程血压下降冠心病患者预后的影响因素。结果 B组患者男性、糖尿病、陈旧性心肌梗死、卒中史、经皮冠状动脉介入治疗(PCI)史、替格瑞洛、β受体阻断剂、质子泵抑制剂、替罗非班比例均高于A组，射血分数低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组患MC3体外者吸烟史、高血压分级比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。B组患者N端B型钠尿肽原、血清磷酸肌酸激酶同工酶(CKMB)、S3-MA体内实验剂量YNTAX评分及病变血管位于左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉、接受PCI治疗、右冠状动脉支架比例均高于A组，高密度脂蛋白、左前降支接受PCI比例均低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。B组患者峰值心率、峰值摄氧量、峰值公斤摄氧量、无氧阈摄氧量、无氧阈公斤摄氧量、峰值代谢当量均低于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示，质子泵抑制剂、高密度脂蛋白、CKMB、左回旋支病变、右冠状medicinal and edible plants动脉病变、接受PCI、左前降支病变接受血运重建、峰值心率均为CPET过程血压下降冠心病患者预后的影响因素(P<0.05)。结论 病变程度与心肺功能均影响CPET过程中血压下降冠心病患者的预后。