ALK抑制剂

目的 剖析2型糖尿病患者采用二甲双胍联合质子泵抑制剂治疗的临床效果。方法 98例接受降糖治疗的2型糖尿病患者,以随机抽签法分为对照组和观察组,每组49例。对照组选用二甲双胍进行降糖治疗,观察组在对照组治疗基础上施加质子泵抑制剂进行降糖治疗。比较两组病情控制效果、用药前后血糖水平、不良反应发生情况。结果 selleck产品观察组总控制率为93.88%,高于对照组的79.59%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组不良反应发生率为4.08%(2/49),低于对照组的16.33%(8/49),差异有统计学意义(P<0.05)。用药后,观察组空腹血糖及餐后2 h血糖分别为(5.35±1.46)、(6.87±1.49)mmol/L,均低于对照组的(8.05±1.66)、(10.05±1.58)mmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 对2型糖尿病患者施行二甲双胍进行常规降糖治疗的同时,联合运用质子泵抑制剂干预,能进一步改善患者血糖水平,使病情得到有效控制,减少不良反应,Dehydrogenase抑制剂值得临床推deformed graph Laplacian行。

目的 剖析2型糖尿病患者采用二甲双胍联合质子泵抑制剂治疗的临床效果。方法 98例接受降糖治疗的2型糖尿病患者,以随机抽签法分为对照组和观察组,每组49例。对照组选用二甲双胍进行降糖治疗,观察组在对照组治疗基础上施加质子泵抑制剂进行降糖治疗。比较两组病情控制效果、用药前后血糖水平、不良反应发生情况。结果 selleck产品观察组总控制率为93.88%,高于对照组的79.59%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组不良反应发生率为4.08%(2/49),低于对照组的16.33%(8/49),差异有统计学意义(P<0.05)。用药后,观察组空腹血糖及餐后2 h血糖分别为(5.35±1.46)、(6.87±1.49)mmol/L,均低于对照组的(8.05±1.66)、(10.05±1.58)mmol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 对2型糖尿病患者施行二甲双胍进行常规降糖治疗的同时,联合运用质子泵抑制剂干预,能进一步改善患者血糖水平,使病情得到有效控制,减少不良反应,Dehydrogenase抑制剂值得临床推deformed graph Laplacian行。

心律失常(Cardiac arrhythmia)为临床常见的心血管病症,具有发病率高、危害性大的特点,可导致心源性猝死(Sudden cardiac death,SCD)的发生。目前仍是全球共同面临的公共卫生问题之一,奎尼丁、胺碘酮等是临床上应用较为广泛的抗心律失常西药,但由于其均有不同程度促心律失常的副作用,该类药物的应用具有一定局限性。然而,天然药物和中药中有多种活性物质可应用于心脑血管领域,从其中寻找具有抗心律失常活性的有效物质,成为发现和开发新药的重要手段之一。目的本课题旨在研究野黄芩素的制备方法,并在活性验证下对其进行结构修饰。通过野黄芩素衍生物对氯化钡和乌头碱诱发大鼠心律失常、心电学指数的影响以及其对电压门控离子通道的调节机制,探究野黄芩素衍生物的抗心律失常活性及作用机制,并与模板分子野黄芩素进行对比。以期发现活性更强、成药性更佳的抗心律失常活性物质,为深入探讨野黄芩素的应用以及抗心律失常药CRISPR Knockout Kits物的开发提供参考。方法1.野黄芩素的制备以野黄芩苷为原料,95%乙醇为溶剂,利用浓硫酸于氮气保护条件下回流4h将其糖苷键水解断裂,得到野黄芩素。2.野黄芩素的结构修饰以野黄芩素为原料,对其A环、B环和A、B环进行结构修饰。首先利用二氯二苯甲烷保护野黄芩素A环上邻二酚羟基得到中间体,其次在中间体B环4’位羟基上引入不同的基团如:吗啉-4-甲酰氯、4-甲基哌嗪-1-甲酰氯、乙基氨基甲酰氯等,最后在钯碳氢气下将保护基脱下,得到目标产物。3野黄芩素衍生物的抗心律失常活性测定本部分先以氯化钡复制大鼠心律失常模型探讨野黄芩素衍生物的抗心律失常活性差异。舌下静脉给药后,记录大鼠心电图和心电学指数,探究野黄芩素及其衍生物的恢复时间和维持时间差异,以及对HR、QT、QTc和RR心电学指数的影响,综合分析筛选出抗心律失常活性较佳的化合物W8、W12和W15。进一步研究化合物W8、W12和W15对乌头碱诱发大鼠心律失常模型的影响。舌下静脉给药后观察大鼠心电图,记录大鼠心脏出现室早(VP)、室速(VT)、室颤(VF)和停搏(CA)的时长,分别换算成乌头碱的用量。探究野黄芩素及其衍AZD6738价格生物所需乌头碱用量的差别,筛选出抗心律失常活性最佳的化合物W12。最后研究化合物W12不同给药剂量(2、4、8和16mg/kg)对氯化钡和乌头碱诱发大鼠心律失常模型的影响,得出最佳给药剂量为8mg/kg。用化合物W12的最佳给药浓度8mg/kg,Docetaxel进一步研究此剂量对健康大鼠正常心电学指数的影响,充分考虑其成药性。4.抗心律失常活性最佳化合物W12的机制研究本部分将研究抗心律失常活性最佳的化合物W12对HFL1和HEK293T细胞毒性情况,考察其成药性。将化合物W12与Nav1.1和Cav1.1进行分子对接,与野黄芩素对比评分情况。应用膜片钳技术探讨该化合物对HEK293细胞Nav1.1和Cav1.2离子通道的作用机制。结果1.野黄芩素的制备情况以野黄芩苷为原料,用浓硫酸对其糖苷键进行水解,经核磁和质谱验证得到野黄芩素。2.野黄芩素的结构修饰情况以野黄芩素为原料,用二氯二苯甲烷保护其A环邻二酚羟基,经核磁和质谱验证得1个A环结构修饰化合物中间体;以中间体为原料,于其B环4’位引入吗啉-4-甲酰氯和氯丁酰氯后钯碳氢气下脱保护基,核磁和质谱验证得到2个B环结构修饰化合物;以中间体为原料,于其B环4’位引入吗啉-4-甲酰氯、4-甲基哌嗪-1-甲酰氯、乙基氨基甲酰氯等,经核磁和质谱验证得到19个A、B环结构修饰化合物。3.野黄芩素衍生物抗心律失常活性测定情况通过探讨野黄芩素衍生物对氯化钡诱发大鼠心律失常的影响情况,发现与野黄芩素比,野黄芩素衍生物均可显著缩短恢复时间(P<0.001);其中化合物W8、W12和W15的维持时间均较长,其中与野黄芩素比,化合物W12可显著延长维持时间(P<0.05),且维持时间大于20min的大鼠只数最多。化合物W8、W12和W15几乎不影响大鼠HR、QT、QTc和RR的心电学指数,且均可纠其指数异常。进一步研究对乌头碱诱发大鼠心律失常的影响,发现与野黄芩素比,化合物W12可显著提高致使大鼠发生室颤(VF,P<0.05)和停搏(CA,P<0.01)的乌头碱用量。探讨化合物W12不同给药剂量(2、4、8和16mg/kg)对氯化钡诱发大鼠心律失常影响情况,发现化合物W12给药标准为8mg/kg时,与野黄芩素比,具有较快的恢复时间(P<0.001)和较长的维持时间,且维持时间大于20min的大鼠只数最多,因此最佳给药标准定为8mg/kg。用最佳给药标准8mg/kg给予健康大鼠,探究化合物W12对大鼠正常心电图的影响,发现与生理盐水组比,化合物W12不会引起大鼠心电学指数异常(P>0.05),与氯化钡组比,化合物W12可显著纠正氯化钡引起的大鼠HR、QT、QTc和RR心电学指数异常(P<0.05)。4.抗心律失常活性最佳化合物W12的机制研究情况化合物W12浓度为25μM时对HFL1和HEK293T细胞均表现出较低的毒性,提示其成药性良好。化合物W12与Nav1.5蛋白和Cav1.1蛋白的结合分数情况均优于野黄芩素。应用膜片钳技术验证了30μM浓度时,化合物W12可使Nav1.5通道开放时间变短,而对Cav1.2通道的IC_(50)值大于30μM。结论本研究所合成的野黄芩素衍生物相比野黄芩素均有起效快的特点,其中化合物W12的恢复时间短、维持时间长且维持时间大于20min的大鼠只数最多。另一方面,化合物W12可显著提高致使大鼠发生室颤(VF)和停搏(CA)的乌头碱用量。给药标准为8mg/kg时,不会引起大鼠心电学指数异常,且可纠正氯化钡引起的大鼠HR、QT、QTc和RR心电学指数异常。化合物W12浓度为25μM时几乎对HFL1和HEK293T细胞无毒性,成药性较好。化合物W12与Nav1.5和Cav1.2离子通道有较强的亲和力,浓度为30μM时会明显加快Nav1.5的失活,而大于30μM时才可检测到Cav1.2通道的IC_(50)值,说明化合物W12对离子通道作用温和,不会过度抑制多个离子通道,有利于离子通道之间恢复平衡。据此,化合物W12可作为具有开发前景的抗心律失常药物深入研究。

光动力疗法(PDT)作为一种无创、低毒、高选择性的癌症治疗方法,已经引起了人们的广泛关注。光敏剂(PS)作为光动力治疗的核心部分,在PDT中起决定性作用。传统PS大多都不溶于水,在水中会发生聚集导致荧光猝灭(ACQ)和活性氧(ROS)产率降低。三苯胺类化合物是一类典型的聚集荧光增强(AIE)染料。一些具有推-拉电子效应的三苯胺染料具有很好的光照产生ROS能力,可作为光敏剂Medicinal earths用于荧光介导的光动力治疗。本论文拟以AIE型三苯胺为母体,通过推-拉电子效应及共轭效应来调控PS的吸收光谱及ROS的产生效率,研究PS对肿瘤细胞的光毒杀能力及肿瘤标记物应激响应能力,得到一些有意义的结果,具体内容如下:(1)近红外发射三苯胺光敏剂的合成及性质研究:以典型的AIE型分子供体三苯胺和受体苯并噻二唑-吡啶盐为母体,在三苯胺上修饰了不同的取代基(硝基、醛基、氢、甲氧基)得到五个新的光敏剂TBZPYME-n(n=1?5)。相比于其前体TBZPY-n(n=1?5),TBZPYME-n具有长波长吸收光谱及高的ROS产生效率。且随着取代基供电子能力的增加,TBZPYME-n的最大吸收光谱在水溶液从454 nm红移至532 nm,它们产生活性氧能力也随之逐渐增强,都远远大于商用光敏剂RB,但其荧光较弱。TBZPYME-5光敏剂在660激光照射下对癌细胞有很好的PDT效果。(2)过氧化氢刺激降解的AIE光敏剂的合成及性质研究:以前一章的TBZPY-4为前体引入苯硼酸酯基团,得到AIE光敏剂TBZPYBE。在水溶液中,TBZPYBE具有Pexidartinib生产商很好的光照ROS产生能力,但其荧光很弱。加入H_2O_2后,及ROS产生能力减弱,但其荧光增强。TBZPYBE成功用于癌细胞光动力治疗。由于其与肿瘤标记物H_2O_2反应后的ROSGefitinib生成效率下降,可很好地解决光敏剂残留对正常组织的毒副作用。同时,TBZPYBE也用于荧光增强成像区别正常细胞及癌细胞,实现诊断和治疗一体化。

CRISPR/Cas系统作为第三代基因组编辑技术,因组装简单、效率高、易操作等优点,被广泛应用于基因组研究中,成为生命科学领域的革命性工具。该系统可以在基因组目标位点介导碱基插入、缺失及精确替换,加速基因功能研究和作物品质改良。然而,一方面由于物种不同、靶点依赖性等原因,CRISPR/Cas系统的编辑效果也有所差异。另外,专利权原因限制了CRISPR/Cas系统的商业化应用。因此,新型Cas蛋白的发现及CRISPR/Cas系统改造,成为目前研究的热点。CRISPR/Cas12i系统属于Class 2中的V-I型,由REC结构域和NUC结构域组成。与Cas12a家族类似,该蛋白由cr RNA引导,识别富含T碱基的PAM序列。CRISPR/Cas12i系统包含多个家族成员。其中,Cas12i1至Cas12i12等12个成员活性在体外和动物细胞内做了相关研究。为了验证CRISPR/Cas12i在植物系统中的基因编辑效果,我们选择CRISPR/Cas12i3基因组编辑工具进行相关工作,工作进展如下:(1)构建CRISPR/Cas12i3介导的水稻编辑体系并成功应用:利用水稻密码子优化的Cas12i3与cr RNA表达盒组装CRISPR/Cas12i3骨架载体,单靶点设计针对水稻内源基因Os YSA、Os NAL、Os MIR396e和Os PYL6,检测该体系编辑效果。结果显示单靶点载体均成功实现基因编辑且编辑效率在6.25%～82.5%,证明CRISPR/Cas12i3在水稻中介导基因编辑的可行性。(2)CRISPR/Cas12i3串联pre-cr RNA(DR-spacer-DR-spacer)构建多靶点编辑体系:因CRISPR/Cas12i3靶点不同编辑效率存在差异,期望以pre-cr RNA(DR-spacer-DR-spacer)串联靶点的方式提高CRISPR/Cas12i3系统编辑效率。本研究构建两个多靶点串联载体Array1和Array2均未发现基因编辑事件的发生,推测Cas12i3加工多重pre-cr RNA(DR-spacer-DR-spacer)效率低。(3)构建Cas12i3介导的成熟cr RNA编辑系统iMAGE(CRIPSR/Cas12i3-based Multiplex DR-spacer Array Genome Editing system),实现多靶点编辑:鉴于Cas12i3显示加工多重pre-cr RNA的低活性,我们设计了成熟cr RNA的编辑系统iMAFulvestrant临床试验GE。本研究利用CRISPR/Cas12i3和iMAGE系统针对水稻Os Nramp5基因分别设计单靶点和多靶点,结果表明,相对于单靶点载体编辑效率的0%～17.7%,使用iMAGE系统随机设计的5个靶点串联载体iMAGE-Array:A和iMBiomass reaction kineticsAGE-Array:B突变效率分别为47.32%和38.39%。iMAGE系统既简化载体构建流程又缩短实验周期,在实现多重编辑的同时提升单个基因突变效率。(4)利用iMAGE系统实现染色体结构变异:染色体结构变异(Structural variation,SV)是加速植物育种的重要动力,我们利用CRISPR/Cas9和iMAGE系统靶向Os HPPD和Os Ubi2构建多靶点载体,证明了Cas12i3蛋白同样介导染色体结构复制,且Cas12i3介导的DNA结构变异频率与Cas9相比更高,推测Cas12i3切割DNA双链产生粘性末端。(5)基于dCas12i3的胞嘧啶碱基编辑器(i BEs)和腺嘌呤碱基编辑器(i ABEs):为了拓宽Cas12i3应用领域,本研究预测Casselleck PEG30012i3催化活性中心并突变成功获得4种dCas12i3突变体,不同突变体与Anc689、Tad A8e分别融合构建胞嘧啶碱基编辑器(i BEs)和腺嘌呤碱基编辑器(i ABEs)系列载体。结果显示i BEs中仅i BE~(844)检测到编辑,i ABEs中4种突变体均实现精确替换。相同的是,i BE~(844)和i ABE~(844)分别在i BEs和i ABEs中效果最佳,推测可能与E844A突变保留了较完整的识别活性有关。总之,i BE~(844)和i ABE~(844)的开发成功将Cas12i3应用于碱基编辑领域。(6)基于dCas12i3~(844)的i ABE~(844)的编辑特征研究:为进一步说明i ABE~(844)编辑范围、效率等特征,在水稻基因组设计25个靶点经潮霉素筛选取阳性愈伤组织检测。高通量测序结果表明,与Cas12a相似,i ABE~(844)主要编辑窗口位于A9-A12位,编辑效率在10%左右。另外,靶向p35S:e GFP~(mut)恢复绿色荧光活性及Os ACC基因突变体的除草剂筛选进一步验证了i ABE~(844)介导碱基精确替换的能力。综上所述,本研究在水稻中证实了CRISPR/Cas12i3具有介导基因编辑的能力,构建融合多个cr RNA表达盒的iMAGE系统成功实现多靶点编辑和染色体结构变异。同时,首次发现4种dCas12i3突变体的碱基编辑器中i BE~(844)和i ABE~(844)编辑活性最佳,并对i ABE~(844)编辑工具特征进行评估。以上研究工作扩充了基因编辑工具,为基因编辑应用提供更多的工具选择。

目的 探究卡前列素氨丁三醇联合麦角新碱在剖宫产术后出血中的应用效果。方法选取2018年6月至2021年9月辽阳市第三人民医院60例剖宫产后出血的患者作为研究对象，按照随机数字表法分为对照组与观察组，各30例。两组患者均接受改良B-Lynch缝合术，对照组采用单纯卡前列素氨丁三醇干预，观察组采用卡前列素氨丁三醇联合麦角新碱干预。比较两组的产后出血量、手术时间、住院时间、临床疗效、宫底高度、宫缩次数、血性恶露时间及并发症发生情况。结果 观察组产后2 h出血量、产后1 d总出血量少于对照组，住院时间短于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组的手术时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；观察组的Hepatocellular adenoma总有效率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)NSC125066使用方法；两组宫底高度、宫缩次数组间、时间及交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组患者术后1、2 h的宫底高度低于对照组，宫缩次数多于对照组同期，差异有统计学意义(P<0.05)；两组并发症总发生率及血性恶露时间比较，Tofacitinib核磁差异无统计学意义(P>0.05)。结论 改良B-Lynch缝合技术联合卡前列素氨丁三醇+麦角新碱应用于剖宫产术疗效确切，降低患者出血量。

目的 探究金丝桃苷(Hyp)对肾病综合征(nephrotic syndrome, NS)大鼠肾自噬及AMPK/mTOR/ULK1通路的影响。方法 32只6周龄SD大鼠分为正常组(N组)、肾病综合征组(NS组)、金丝桃苷组(Hyp组，60 mg/kg Hyp)、金丝桃苷+AMPK抑制剂组(Hyp+CC组，60 mg/kg Hyp+0.2 mg/kg CC),每组8只。除N组外，其余各组大鼠采用一次性尾静脉注射阿霉素(6.5 mg/kg)建立NS模型，模型成功率为75.0%。Hyp组大鼠灌胃给予60 mg/kg的Hyp, Hyp+CC组给予60 mg/kg的Hyp灌胃和0.2 mg/kg CC腹腔注射，N组和NS组给予等量溶剂，每天1次，连续14 d。给药结束后，全自动分析仪检测24 h尿液总蛋白(UTP)、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)和白蛋白(ALB)水平；HE染色观察肾组织病理形态；透射电子显微镜(TEM)观察肾组织超微结构变化；Western blot检测肾中自噬、足细胞及AMPK/mTOR/ULK1通路蛋白表达；免疫荧光染色观察自噬体和足细胞的定位。结果 相比于N组，NS组肾小球体积变大、肾小管萎缩或部分消失、基底膜增厚；UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、AtPersistent viral infectionsg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低(P<0.05)。相比于NS组，Hyp治疗可改善肾小球形态，降低UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值(P<0.05),增加ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p寻找更多-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值(P<0.05)。相比于Hyp组，Hyp+CC组肾小球体积变大、肾小管萎缩或部分消失、基底膜增厚；UTP、BUN、Scr、基底膜厚度、足突宽度及p-AMPK/AMPK比值显著增加(P<0.05),ALB、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2蛋白水平、NPHS2、Beclin-1相对荧光强度及p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值显著降低(P<0.05)。结论 Hyp可能通过激活AMPK/mTOR/UEnasidenib分子量LK1通路促进肾细胞自噬活性，减轻NS大鼠的足细胞损伤等肾病变。

目的 观察EGFR-TP53共突变型晚期非小细胞肺癌患者采用EGFR-TKI靶向同步化疗、EGFR-TKI单靶治疗序贯化疗、EGFR-TKI单靶治疗序贯靶向联合化疗的效果及预后情况，探讨最佳治疗方案。方法 2016年6月-2021年8月河南省人民医院诊治EGFR-TP53共突变型晚期非小细胞肺癌患者229例，其中一线EGFR-TKI单靶治疗111例(其中40例治疗后进展且无驱动基因突变),EGFR-TKI靶向同步化疗71例(靶向同步化疗组),EGFR-TKI靶向同步抗血管生成药物治疗32例，化疗15例。患者从治疗起始每2个周期行影像学等检查，采用RECIST标准评估疗效，至患者死亡或随访结束。采用单因素及多因素Cox回归分析EGFR-TP53共突变型晚期非小细胞肺癌患者预后的影响因素。40例一线EGFR-TKI单靶治疗后进展且无驱动基因突变者分为单靶序贯靶向联合化疗组24例和单靶序贯化疗组16例。比较靶向同步化疗组、单靶序贯靶向联合化疗组和单靶序贯化疗组客观缓解率、疾病控制率及治疗反应持续时间≥3个月比率；绘制Kaplan-MeICI 46474浓度ier曲线，采用log-rank检验比较3组总生存期及无疾病进展生存期。结果 一线治疗Biobased materials方案中EGFR-TKI靶向同步化疗是EGFR-TP53共突变型晚期非小细胞肺癌患者预后良好的影响因素(HR=0.597,95%CI:0.383～0.932,P=0.023)。靶向同步化疗组、单靶序贯靶向联合化疗组、单靶序贯化疗组客观缓解率(49.3%、54.2%、31.3%)、疾病控制率(97.2%、95.8%、87.5%)及治疗反应持续时间≥3个月比率(88.7%、91.7%、81.3%)比较差异均无统计学意义(P>0.05)。单靶序贯靶向联合化疗组中位总生存期(1 542 d)、中位无疾病进展生存期(722 d)均长于靶向同步化疗组(826、487 d)、单靶序贯化疗组(515、278 d)(P<0.05),靶向同步化疗组中位无疾病进展生存期长于单靶序贯化疗组(χ~2=4.464,P=0.035),中位总生存期与单靶序贯化疗组比较差异无统计学意义(χ~2=0.278,P=0.598)。结论 化疗协同EGFR-TKTalazoparib采购I靶向治疗可增加EGFR-TP53共突变型晚期非小细胞肺癌患者对EGFR-TKI靶向药物的敏感性，改善患者预后；靶向同步化疗可作为一线治疗方案，单靶治疗进展后可选择靶向联合化疗治疗。

叶绿素是植物进行光合作用的关键色素,在体内与众多色素蛋白结合形成复合体。叶绿素与色素蛋白的结合一方面具有稳定色素蛋白的作用,另一方面又PS-341抑制剂会进一步影响色素蛋白与其它复合体或者蛋白质的互作,调控一系列相关的生物学过程。酵母双杂交技术是最常用的筛选互作蛋白的一种手段,但由于酵母本身不能合成叶绿素分子,因此很难用于筛选与色素蛋白互作的蛋白质。为了解决这个问题,本研究以酿酒酵母菌株AH109与By4742为底盘细胞,运用合成生物学的思路探索了酵母中重构叶绿素合成途径的可能性。叶绿素合成途径中的第一个酶是镁螯合酶。首先,克隆了拟南芥来源的编码镁螯合酶三个亚基的基因,即AtCHLI、AtCHLD、AtCHLH,并将它们分别整合到酵母p DEST系列载体上。AtCHLI与AtCHLD构建到p DEST32上(p DEST32-AtCHLI-AtCHLD),而AtCHLHSCH772984分子量构建到p DEST22上(p DEST22-AtCHLH)。然后,将p DEST32-AtCHLI-AtCHLD与p DEST22-AtCHLH共转化至菌株AH109,得到工程菌株AH109-AMG。利用HPLC测定工程菌株AH109-AMG的原卟啉与镁原卟啉含量。虽然相对于野生型菌株Aviral immune responseH109,AH109-AMG的原卟啉积累减少,但检测不到镁原卟啉。基于叶绿素合成途径中的中间体具有光敏剂的特性,为了防止这些中间体对酵母细胞生长的影响,我们选用了诱导型启动子Gal1驱动表达载体pESC-LEU,并将AtCHLI、AtCHLD、AtCHLH基因与集胞藻PCC6803来源的镁螯合酶基因Sy CHLI、Sy CHLD、Sy CHLH构建到pESC-LEU上。Western Blot检测表明在菌株By4742中能诱导表达拟南芥与集胞藻PCC6803镁螯合酶的单个亚基。利用By4742基因组上的rdna多拷贝位点,我们将镁螯合酶的三个基因整合到酵母的基因组中,尝试获取可以稳定表达镁螯合酶全酶的菌株。相关基因的表达水平正在检测中。总体来说,本研究结果表明酵母中能异源表达镁螯合酶,虽然没有检测到产物镁原卟啉,但为进一步研究奠定了较好的基础。

背景:世界卫生组织数据显示,腹泻病是造成五岁以下儿童死亡的第二大原因,每年约有52.5万名五岁以下儿童死于腹泻病。研究也表明母乳喂养能够降低婴幼儿腹泻的发病率与死亡率,其与母乳成分中的免疫活性成分相关,研究报道乳铁蛋白(Lactoferrin, LF)和骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)均能调节机体免疫、促进免疫系统的成熟,然而婴幼儿配方奶粉中同时添加两种蛋白是否有协同作用以及其最适Symbiont-harboring trypanosomatids宜比例尚需进一步研究。方法:小鼠适应一周后,按照300mg/kg体重给予其乳铁蛋白和骨桥蛋白的混合物,比例为LF:OPN=1:0、1:10、1:5、1:1、1:0.2、1:0.2、0:1,对照组灌喂同等剂量的生理盐水,连续进行七天灌喂,每两天记录一次体重,模型组不灌喂蛋白混合物或生理盐水。在第七天结束后腹腔注射脂多糖(LPS)造模,第八天处死小鼠,收集血液、肠道组织样品。肠道组织进行切片病理学评价,如损伤评分、隐窝深度、绒毛长度等,并对肠道病理学完整性进行评价,包括紧密连接蛋白的表达量和杯状细胞的数量。血清样本检测D-乳酸、二胺氧化酶(DAO)、炎症因子(IL-6、IL-1β、IL-10、IL-4、TNF-α)的含量,用于评估肠组织炎症反应和肠屏障受损状况。结果:1、模型组DAO活性、D-乳酸含量相比于对照组显著升高,浓度约为对照组的2倍,差异具有统计学意义,表明LPS破坏了肠屏障的完整性,增加肠道通透性。与模型组相比,各处理组均显著降低了血清中DAO的活性以获悉更多及D-乳酸含量,均具有点击此处统计学差异。其中,当LF:OPN=1:10～1:1、1:0.1相较于LF、OPN单体,小鼠血清DAO的活性以及D-乳酸含量。2、模型组的肠道组织的绒毛长度变短、隐窝深度变浅,出现上皮细胞脱落以及炎症浸润的现象。损伤评分量化肠道的损伤程度显示,模型组HE损伤得分(11.6)显著高于对照组(2.24),各蛋白混合物均降低了HE损伤得分,当LF:OPN=1:5时,HE损伤得分最低(4.66),与模型组相比具有显著差异。同时统计了绒毛长度、隐窝深度,发现模型组显著下调了绒毛长度以及隐窝深度,不同比例蛋白对此均有显著的改善作用。3、在蛋白混合物的干预下,相比于对照组和模型组,紧密连接表达量上调;与模型组相比,单体以及混合蛋白均显著提高了杯状细胞的数量,具有统计学差异;相比于对照组,模型组的促炎因子IL-6、IL-1β的表达量上调,抗炎因子IL-10的表达下降;同时,蛋白混合物的干预可以缓解IL-6、IL-1β的增加以及IL-10的下降。结论:乳铁蛋白和骨桥蛋白的在保护小鼠肠道屏障、抵抗肠炎方面具有正向协同作用,其为婴儿配方的创制提供了数据支持。