ALK抑制剂

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)作为热加工食品美拉德反应的重要产物,具有生殖毒性、神经毒性、肝毒性和潜在的致癌性。肝脏是AA代谢的主要场所也是AA攻击的主要靶器官,热加工食品中AA的肝毒性引起广泛关注。AA诱导的肝毒性与氧化应激关系密切,线粒体ROS(mt ROS)引发的线粒体氧化应激是机体氧化应激的主要来源。氧化应激直接参与铁死亡和细胞焦亡等细胞死亡方式。铁死亡依赖铁离子,以脂质过氧化和抗氧化系统失调为特征。氧化应激通过激活炎性小体,诱导炎症因子释放,打开细胞焦亡经典通路。本研究旨在通过建立AA染毒大鼠肝星状细胞(HSC-T6细胞)模型,探究AA对HSC-T6细胞mt ROS释放以及诱导铁死亡、细胞焦亡发生的机制,进一步阐明mt ROS对铁死亡和细胞焦亡的作用,为最终揭示AA肝毒性机制奠定研究基础。本论文主要研究内容及结果如下:(1)AA损伤HSC-T6细胞线粒体功能并释放mt ROS。建立AA(0,0.5,1,2 m M)染毒HSC-T6细胞模型,通过检测LDH、ALT和AST的水平变化,HSC-T6细胞被2 m M AA处理后LDH、ALT和AST水平值分别为对照组的1.4、2.9、3.5倍,确定AA对细胞造成损伤;通过Western Blot考察HSC-T6细胞膜孔蛋白VDAC1表达水平,测定线粒体膜电位(MMP)medullary rim sign,ATP水平以及透射电镜观察线粒体结构,得出AA诱导VDAC1蛋白表达升高,MMP和ATP水平下降,线粒体结构受损,确定AA造成线粒体结构功能损伤;通过检测mt ROS释放水平,确定AA增加mt ROS释放量。(2)AA诱导的mt ROS释放致XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡,引发HSC-T6细胞铁死亡。通过Western Blot对HSC-T6细胞铁死亡关键蛋白表达水平考察,测定HSC-T6细胞GSH、MDA和Fe~(2+),得出AA影响关键蛋寻找更多白表达,提高MDA和Fe~(2+)水平含量,下调GSH水平,确定AA影响HSC-T6细胞XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路;采用5μM铁死亡抑制剂Fer-1,通过Western Blot考察HSC-T6细胞铁死亡关键蛋白表达水平,测定GSH、MDA和Fe~(2+),确定AA通过造成XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡诱导HSC-T6细胞铁死亡;通过加入50μM mt ROS清除剂Mito-TEMPO检测铁死亡关键蛋白表达,得出Mito-TEMPO恢复XCT-GSH-GPX4抗氧化系统,确定AA诱导HSC-T6细Enasidenib采购胞mt ROS释放促进铁死亡的发生。(3)AA诱导mt ROS释放激活NLRP3-caspase1-GSDMD通路致HSC-T6细胞焦亡。通过对SOD酶活性和ROS释放水平检测,得出AA诱导ROS释放量增加,SOD酶活性受到抑制,确定AA诱导氧化应激;通过Western Blot考察NLRP3-caspase1-GSDMD通路相关蛋白表达情况、通过试剂盒检测下游炎症因子水平,发现AA上调NLRP3、GSDMD、caspase1蛋白表达和IL-18、IL-1β炎症因子释放水平,确定AA激活NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路致HSC-T6细胞焦亡;通过加入mt ROS清除剂Mito-TEMPO检测细胞焦亡关键蛋白表达,得出Mito-TEMPO抑制NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路,确定AA诱导HSC-T6细胞mt ROS释放促进细胞焦亡的发生。综上所述,AA通过诱导线粒体功能障碍从而释放mt ROS。mt ROS能够诱导XCT-GSH-GPX4抗氧化信号通路失衡致HSC-T6细胞铁死亡。又通过激活NLRP3-caspase1-GSDMD信号通路诱导HSC-T6细胞焦亡。

4-叔丁基苯酚(4-tert-butylphenol,4-t BP)是一种广泛用于农业和工业的环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)。4-t BP具有中度生物蓄积性、环境持久性和长期毒性的特点。通过食物链的生物放大效应,4-t BP在鱼类等动物体内高浓度富集,威胁水生动物的健康,如引起代谢性疾病。肝胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是一种复杂的代谢性疾病,与长期暴露于EDCs密切相关。然而,4-t BP是否能诱导肝IR尚不清楚。目前IR被发现与环境污染物诱导的多种细胞生物学途径密切相关,如自噬、细胞钙稳态、和细胞铁死亡。Micro RNA(mi RNA)是肝IR的关键调节因子,也是环境EDCs造成机体损伤的潜在中介因子。在此,本研究建立体内鲤鱼4-t BP暴露模型和体外鲤鱼原代肝细胞,鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC),及草鱼肝细胞系(grass carp hepatocyte line,L8824)的4-t BP暴露模型。应用组织/细胞染色法、透射电子显微镜、转录组学检测技术、双荧光素酶报告基因检测法、细胞转染技术、实时荧光定量PCR技术、Western blot法、免疫荧光技术、及流式细胞术,检测了肝-体指数(hepatosomatic index,HSI)、血清生化指标、肝脏组织形态学变化、mi RNA和m RNA表达谱、坏死细胞数量及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)水平,构建了mi RNA-m RNA调控网络并进行验证、筛选与检测了肝IR、自噬、钙稳态和铁死亡相关信号转导通路。本研究旨在探索mi RNA-m RNA调控网络是否参与以及调控4-t BP诱导的肝毒性,为4-t BP毒理学研究提供科学依据。同时为IR相关疾病提供可能的预防和治疗靶点,为动物健康养殖提供环境决策依据。主要研究结果如下:(1)4-t BP暴露60天后引起鲤鱼HSI显著增加,提示4-t BP暴露引起鲤鱼肝代谢异常。(2)鲤鱼血清/肝脏生化指标的检测结果显示,4-t BP暴露引起反应肝损伤的血清指标(ALT、AST、LDH和GGT)显著提高,提示4-t BP暴露诱导鲤鱼肝损伤。另外,4-t BP引起IR的血清生化指标FBG和ABT-199核磁FINS水平以及HOMA-IR和HOMA-ISI值的异常,提示4-t BP暴露诱导鲤鱼IR。并且血清和肝脏中脂质生化指标显示,暴露于4-t BP后,TC、TG和LDL-C的水平明显升高,而HDL-C显著降低,该结果进一步为4-t BP暴露诱导鲤鱼肝IR提供了证据。(3)组织病理学观察结果显示,4-t BP暴露后破坏了鲤鱼的肝脏组织形态。另外,在4-t BP暴露的肝组织PAS染色图谱及油红O染色图谱中发现了肝IR的标志性变化,即肝糖原合成减少和肝脏脂质累积。透射电子显微镜下,4-t BP暴露后的肝细胞出现了铁死亡的标志性特征,提示4-t BP诱导肝脏组织损伤,可能与肝IR和细胞铁死亡密切相关。(4)通过筛选与分析mi RNA和m RNA的表达谱,发现70个差异表达mi RNAs和1484个差异表达的m RNAs(符合|log_2fold change|>1和P<0.05)参与了4-t BP诱导的鲤鱼肝毒性的分子机理。其中mi R-363是差异表达最显著的mi RNA,且与IR密切相关。并且对这1481个差异表达的m RNAs进行GO富集分析和KEGG富集分析发现铁死亡、氧化应激、自噬、钙信号以及IR可能参与了4-t BP诱导的鲤鱼肝毒性。(5)使用mi Randa软件预测mi R-363的潜在靶m RNA,结合m RNA测序结果筛选与mi R-363表达趋势相反(即显著上调)的潜在靶m RNA。筛选结果显示PKCδ和CACNA1D可能是mi R-363的靶基因。双荧光素酶报告基因检测及体外细胞转染试验进一步验证了mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴的存在。(6)根据KEGG富集分析结果和其他研究者的报道,PKCδ和CACNA1D与肝IR密切相关。q RT-PCR技术检测发现4-t BP引起mi R-363表达的下降伴随着PKCδ和CACNA1D表达升高,以及肝IR相关的差异表达的m RNAs(包括TNF-α、TNFR1、IL-6、m TOR、RPS6K和IRS1)的表达水平的变化,提示4-t BP诱导了鲤鱼肝IR。此外,mi R-363的抑制和4-t BP暴露均会损伤肝糖原的合成,而过表达mi R-363可缓解4-t BP诱导的肝糖原合成受损。并且4-t BP与mi R-363 mimic联合处理可以显著改善独立的4-t BP暴露引起的上述肝IR相关因子的表达变化。进一步地,PKCδ特异性抑制剂粗糠柴苦素(rottlerin,Rot)的预处理、以及si RNA PKCδ和si RNA CACNA1D的转染处理均显著逆转了mi R-363 inhibitor导致的IL-6、IRS1、m TOR和RPS6K的m RNA表达的变化。研究结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴参与了4-t BP诱导的肝IR。(7)q RT-PCR技术和Western blot法结果显示4-t BP暴露引起Calpain2和p62的表达显著增加,而ATG7,ATG5,和LC3b的表达显著降低,提示4-t BP诱导了鲤鱼肝脏自噬受损。自噬标志因子(LC3b和p62)的免疫荧光染色显示,mi R-363 mimic预处理后显著缓解了4-t BP刺激导致的LC3b的荧光强度降低和p62的荧光强度增加。过表达mi R-363可以显著改善4-t BP暴露引起的上述自噬相关因子的表达变化。并且,mi R-363 inhibitor显著降低了LC3b的荧光强度,增加了Calpain2和p62的m RNA表达,降低了ATG7、ATG5和LC3b的m RNA表达,这与4-t BP暴露引起的趋势一致。有趣的是,Rot的预处理、以及si RNA PKCδ和si RNA CACNA1D的转染处理均显著逆转了mi R-363 inhibitor导致的上述变化。结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴参与了4-t BP诱导的自噬受损。(8)暴露于4-t BP导致Ca~(2+)信号相关的DEGs(包括CALM2和CAMKII)的表达水平显著增加及Ca~(2+)的荧光强度显著升高。而mi R-363 mimic预处理显著缓解了4-t BP引起的CALM2和CAMKII表达水平的增加和Ca~(2+)的荧光强度的升高。另外,mi R-363 inhibitor显著增加了CALM2和CAMKII的表达水平,以及Ca~(2+)的荧光强度。有趣的是,Rot的预处理、以及si RNA PKCδ和si RNA CACNA1D的转染处理均显著缓解了mi R-363 inhibitor导致的上述变化。研究结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴参与了4-t BP诱导的Navitoclax半抑制浓度细胞钙超载。(9)自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)和钙通道阻滞剂硝苯地平(nifedipine,Nif)的添加均显著逆转了4-t BP引起的IR相关基因的表达变化(TNF-α、TNFR1、IL-6、m TOR和RPS6K的表达水平的显著增加,和IRS1的表达显著下降)通过激活自噬和抑制Ca~(2+)通道,这与mi R-363 mimic的效应相一致。结果表明4-t BP通过自噬受损和Ca~(2+)超载诱导了肝IR。(10)根据获得的GO和KEGG富集分析显示,6个差异表达的m RNAs(HSPA5、ATF4、SLC7A11、GCLC、GSS和GPX4)与细胞铁死亡相关。此外,应用流式细胞术和AO/EB染色发现细胞坏死率随4-t BP浓度的升高而明显增加。透射电子显微镜观察L8824细胞发现细胞铁死亡的标志性特征,4-t BP暴露后的肝细胞的线粒体皱缩,线粒体嵴减少,线粒体膜密度增加,这与体内试验的发现一致。并且,4-t BP暴露后导致肝细胞的MMP显著降低,铁死亡相关DEGs(HSPA5、ATF4、SLC7A11、GCLC、GSS和GPX4)的表达水平显著下降。有趣的是,铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)预处理缓解了4-t BP引起的上述趋势,提示4-t BP诱导了肝细胞铁死亡。(11)KEGG和GO富集分析显示,4个差异表达的m RNAs(NCOA4、FTH1、STEAP3和SLC40A1)与铁稳态相关。暴露于4-t BP后,NCOA4和STEAP3的m RNA和蛋白水平均显著升高,而FTH1和SLC40A1的m RNA水平显著降低。另外,4-t BP暴露后,鲤鱼肝组织的总铁含量也显著提高了58.9%。在体外试验中,4-t BP组也表现出与体内试验相同的趋势,有趣的是,Fer-1预处理缓解了4-t BP引起的上述趋势。提示4-t BP诱导肝细胞铁超载,与细胞铁死亡密切相关。(12)试验发现,暴露4-t BP后鲤鱼肝组织的抗氧化酶(SOD、CAT、GPX、GSH和GST)的活性显著降低,说明4-t BP降低鲤鱼肝脏的抗氧化能力。暴露4-t BP引起H_2O_2和MDA水平显著升高,说明4-t BP导致鲤鱼肝脏组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)过度累积和脂质过氧化水平升高。并且,4-t BP诱导鲤鱼肝组织的NO和i NOS活性明显升高,说明4-t BP导致鲤鱼肝脏组织清除活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的能力下降。此外,在鲤鱼原代肝细胞中,4-t BP组GPX1、SOD1、CAT、OXR1b和PRDX1水平较对照组显著降低,而ROS水平显著升高。有趣的是,Fer-1预处理后显著缓解了4-t BP诱导的上述变化。上述结果表明4-t BP诱导了鲤鱼肝氧化应激,且与细胞铁死亡密切相关。综上所述,长期暴露于4-t BP会导致鲤鱼HSI升高,血清生化指标异常,提示鲤鱼肝脏损伤。进一步发现4-t BP诱导肝IR、自噬受损和钙超载的发生。在体外,我们进一步证明了4-t BP诱导的上述变化与mi R-363的减少有关。首次验证了mi R-363与PKCδ以及mi R-363与CACNA1D之间的靶向关系。此外,mi R-363 mimic通过抑制PKCδ和CACNA1D缓解了4-t BP诱导的自噬受损、钙超载和肝IR。特异性抑制PKCδ和CACNA1D可缓解mi R-363inhibitor引起的自噬受损、钙超载和肝IR。自噬的激活和Ca~(2+)通道的抑制被发现可以改善4-t BP诱导的肝IR。我们的上述研究结果表明,mi R-363/PKCδ轴和mi R-363/CACNA1D轴通过自噬受损和钙超载参与了4-t BP诱导的肝IR。此Abortive phage infection外,铁死亡是肝IR的诱因之一。本研究发现细胞铁死亡也参与了4-t BP诱导的肝损伤机制,并且Fer-1缓解了诱导肝IR的相关因素(GPX4的下降、铁超载和氧化应激),提示细胞铁死亡可能也参与了4-t BP诱导的肝IR。总之,本研究结果不仅为4-t BP毒理学研究提供了科学依据,为动物健康养殖提供环境决策依据。

商陆是民间使用的传统中医药，具有抗肿瘤、抗炎、泻下、利尿、祛痰平喘、抗病毒、增强免疫力与保护造血功能等作用，常被用于治疗多种疑难杂症。商陆的主要化学活性成分中，商陆皂甙辛、商陆多糖、商陆素可通过促进脾细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞以及造血细胞的增殖分化来调节免疫Staurosporine分子式功能和保护造血功能，凝集素美洲商陆通过下调细胞HLA-DR分子及MHC-I类分子增强免疫功能。免疫性血小板减少性紫癜(Immune thrombocytopenia, ITP)与人体自身的免疫力以及血小板生成息息相关，文章通过查阅近年国内外相关文献，从增强免疫力和保护造血功能两方面分析中药商陆治疗免疫性血小板减少性紫癜的作用机制，归纳分析临床应用以商陆为君药或臣药的方剂治疗免疫性KPT-330血小板减少性紫癜的biopolymer gels经验，以便为免疫性血小板减少性紫癜的临床治疗和研究提供新的相关依据。

背景:铜死亡作为一种新颖的细胞死亡方式,它FUT-175与细胞内的能量代谢和线粒体有关,并在癌症的发生中起作用。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)与肝癌(HCC)的进展和预后有关。但是铜死亡相关的lncRNA在肝癌中的作用和预后价值尚未明确。本研究构建了肝癌中与铜死亡相关lncRNA的预后模型,并且评估该模型的预后价值。方法:我们从TCGA中下载肝癌的mRNA和lncRNA表达谱和相应的临床数据,并获得832个与铜死亡相关的lncRNA。经过单因素,least absolute shrinkage Telaglenastat小鼠and selection operator(LASSO)和多因素Cox回归构建了5个与铜死亡相关的lncRNA预后基因,并根据模型将患者分为高低风险组。采用Kaplan-Meier analysis,receiver operating characteristic(ROC)curve,,C-index,independent prognostic analysis,nomogram model和principal component analysis(PCA)等来评估预后模型的预测能力。同时还探索了该模型的免疫浸润、免疫阻断、药物敏感性、基因突变等情况。最后针对模型中的5个lncRNA,分别对其进行临床预后和单基因Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析。结果:高风险组肝癌患者的总体生存期(OS)、无进展生存期(PFS)、疾病特异性生存期(DSS)和无病间期(DFI)较短。风险模型在训练集,验证集和完整集中对肝癌的预测价值良好,训练集(1年:AUC=0.762,3年:ACU=0.725,5年:AUC=0.772),验证集(1年:AUC=0.732,3年:ACU=0.653,5年:AUC=0.590),完整集(1年:AUC=0.752,3年:ACU=0.701,5年:AUC=0.682)。随后我们将风险模型与肝癌临床亚组分别进行讨论,发现在大部分临床亚组分型中,该模型同biosilicate cement样具备良好的预测价值。单因素和多因素分析模型风险和肝癌临床因素对肝癌预后结局的影响,结果表明在三个数据集中,无论是单因素还是多因素分析,模型风险都能独立预测肝癌的生存结局。Nomogram和其校正曲线显示,与未纳入风险模型相比,纳入模型能够更好的评估肝癌患者的整体预后情况。不仅如此,我们还探究了该模型与肝癌免疫的联系,我们发现该模型划分的高低风险组之间存在免疫细胞(imc)和免疫功能(imf)的差异,不仅如此模型高低风险组之间还存在免疫检查点的差异,这为我们提供了该模型的免疫机制,还从侧面说明了该模型作为免疫治疗的价值。为了更好的贴近临床,我们还对高低风险组进行了药物敏感性分析,结果提示Sorafenib和Paclitaxel对高风险患者更有效。结论:构建了肝癌中与铜死亡相关的lncRNA模型,探索了该模型的预后价值和免疫浸润。与肝癌其他临床因素相比,该风险模型的临床和预后价值高于肝癌的其他临床因素,该模型不仅具备诊断价值,而且与肝癌的临床分期,生存预后,免疫浸润,药物敏感性密切相关,其构成模型的5个lncRNA(AC026412.3、AC107021.2、AL355574.1、AL031985.3、AL117336.2)也具备一定的诊断和临床价值,可以作为肝癌的潜在生物标志物,有成为治疗靶点的可能。为进一步研究肝癌患者的预后相关机制提供了一个崭新的角度。

背景:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是严重的中枢神经系统(central nervous system,CNS)创伤性疾病~([1])。中国SCI的年发病率约为37/100万,给个人和社会带来了沉重的医疗和经济负担~([2])。然而遗憾的是,由于SCI病理机制的复杂性和CNS神经元的不可再生性,SCI的临床治疗缺乏理想的方法。因此,探寻创新有效的 SCI治疗方案仍然是神经科学的重大任务,需要对SCI的病理机制进行深入研究。神经元死亡是SCI后神经功能障碍的直接原因,除了原发性损伤之外,炎症反应、缺血缺氧等也是影响神经元存活的继发性因素~([1])。铁死亡是一种程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),以铁离子过载和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的积聚诱导细胞发生脂质过氧化为主要特征~([3])。细胞铁死亡参与多种疾病。根据现有研究提示,SCI后组织大量出血、溶血导致损伤局部出现铁离子超载,诱发神经细胞发生铁死亡;同时应激反应激活大量ROS的产生,使用铁死亡抑制剂去铁胺等可抑制铁死亡,从而促进SCI后功能恢复~([4])。小胶质细胞介导的促炎性反应参与脊髓继发性损伤,其中损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)结合~([5]),启动TLRs/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)信号级联。铁死亡发生常常伴随小胶质细胞的促炎性激活,然而小胶质细胞在SCI后神经元铁死亡过程中发挥的作用及其分子机制尚不清楚。因此,探索小胶质细胞My D88信Indirect immunofluorescence号对SCI后神经元铁死亡的调控作用及其可能的分子机制,可更好地认识SCI继发性损伤机制,并可为新的SCI治疗策略LGK-974分子式和靶点提供研究依据。研究目的:本研究旨在通过小鼠SCI模型和细胞培养实验的研究,阐明小胶质细胞My D88信号对神经元铁死亡发生发展中的调控作用及分子机制,以探寻挽救SCI过程中神经元铁死亡的新靶点。1、建立小鼠SCI模型探讨SCI后神经元铁死亡与小胶质细胞促炎性激活之间的关系。2、通过体内外实验探索促炎性激活的小胶质细胞在神经元铁死亡中发挥的作用与调控机制。研究方法:1、使用小鼠脊髓夹伤模型作为SCI的在体研究模型,使用神经元细胞系SH-SY5Y和小鼠原代神经元氧糖剥夺/复氧模型(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)作为离体实验研究模型。2、BMS(Basso Mouse Scale)评分和步态分析评估小鼠SCI后运动功能恢复情况。3、苏木精伊红染色(hematoxylin eosin,HE)检测小鼠SCI后损伤中心空洞大小。4、通过测定组织铁浓度和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量反映脊髓组织铁积累和抗氧化水平。5、通过蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)及免疫荧光染色实验观察组织和细胞各相关蛋白分子的表达改变情况。6、通过共培养小胶质细胞和神经元细胞观察两者间的互作关系。7、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色结合流式细胞术观察神经元细胞死亡率。8、CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测神经元细胞活力改变情况。9、通过丙二醛(malondialdehyde,MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4HNE)水平检测神经元内脂质过氧化情况。10、通过BODIPY C11 581/591荧光探针检测神经元内Lipid ROS产生情况。11、用透射电镜观察脊髓神经元细胞内线粒体形态。12、通过荧光探针JC-1检测神经元细胞内线粒体膜电位改变情况。13、引入My D88~(f/f);TMEM119-Cre/ERT转基因小鼠,观察特异性敲除小胶质细胞My D88对SCI后神经元铁死亡的影响。14、用荧光原位分子杂交显示条件敲除小鼠脊髓的My D88 m RNA分布。研究结果:第一部分神经元铁死亡和小胶质细胞My D88信号激活同时出现于脊髓损伤区域用野生型(wild type,WT)小鼠建立SCI模型后,检测组织铁浓度及还原型GSH水平,发现SCI后三天组织铁含量显著升高,还原型GSH明显下降。此外,免疫荧光染色结果显示邻近损伤中心的神经元长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)表达显示增多。通过SCI小鼠的脊髓免疫荧光染色,我们发现发生脂质过氧化的神经元旁有明显活化的小胶质细胞。Western Blot结果显示,SCI后铁死亡信号激活,同时My D88/NF-κB信号通路显著激活。第二部分促炎性激活的小胶质细胞My D88上调促进神经元铁死亡CCK8法检测细胞活力结果显示,OGD/R处理使SH-SY5Y细胞活力降低;而使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的小胶质细胞条件培养基(conditional medium,CM)可以在OGD/R基础MS-275细胞培养上进一步显著降低SH-SY5Y细胞活力。PI染色后进行流式分析结果同样表明,在OGD/R处理的基础上,LPS刺激过的小胶质细胞CM可以进一步提高SH-SY5Y细胞死亡率。相一致的,Western Blot检测表明,CM培养的SH-SY5Y细胞中铁死亡分子谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)的蛋白水平显著下降。另外,被LPS刺激后,促炎性激活的小胶质细胞My D88、NF-κB p65、i NOS表达显著升高;而在My D88抑制剂ST2825作用下,LPS刺激的小胶质细胞促炎性激活被显著抑制,而且这种小胶质细胞的CM不会进一步加剧OGD/R的SH-SY5Y细胞活力下降和死亡率升高。相似的,用Transwell将OGD/R处理的神经元与LPS处理的小胶质细胞共培养后,神经元细胞活力进一步下降,死亡率进一步升高。ST2825可以明显抑制小胶质细胞因LPS刺激而升高的My D88/NF-κB表达及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)和细胞因子IL-1β的表达;将其与OGD/R处理的神经元共培养后,神经元细胞活力下降和死亡率升高的现象有所改善。细胞免疫荧光染色显示,共培养的神经元细胞Lipid ROS的表达显著降低,提示神经元脂质过氧化被抑制。检测神经元的丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量进一步证明,小胶质细胞My D88信号上调促进共培养的神经元脂质过氧化。Western Blot证明,抑制小胶质细胞My D88表达后,共培养的神经元铁死亡信号被明显抑制。荧光染色检测神经元线粒体膜电位JC-1证明促炎性活化的小胶质细胞进一步损伤神经元线粒体。第三部分小胶质细胞特异性My D88缺失抑制SCI后神经元铁死亡,并促进运动功能恢复他莫昔芬灌胃诱导TMEM119-Cre ERT;My D88~(flox/flox)转基因小鼠小胶质细胞中My D88的特异性敲除(My D88 CKO),通过荧光原位分子杂交和Western Blot证明特异性敲除小胶质细胞My D88的转基因小鼠构建成功。用该小鼠建立SCI模型比对照小鼠更早出现后肢站立、运动功能恢复更快且更好;HE染色也证明My D88 CKO小鼠SCI后脊髓组织损伤空洞较My D88 f/f小鼠的空洞更小。透射电镜结果证明,My D88 CKO小鼠SCI急性期损伤周边神经元异常线粒体较少,线粒体缩小程度下降。组织Western Blot检测进一步证实,My D88 CKO SCI小鼠SCI较同窝对照组脊髓My D88/NF-κB通路明显抑制,同时铁死亡信号通路同样明显减弱,损伤中心附近神经元脂质过氧化减轻,与还原型GSH的检测结果也相一致。第四部分小胶质细胞My D88信号参与脊髓损伤后神经元铁死亡的潜在机制在小胶质细胞与OGD/R处理的神经元共培养体系中,Western Blot与细胞免疫荧光染色表明,LPS刺激使小胶质细胞中的铁调素(hepcidin)表达升高,而与LPS激活的小胶质细胞共培养的神经元铁转出蛋白(ferroportin,FPN)表达在OGD/R基础上显著下降,转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tf R)显著升高。但是当小胶质细胞My D88受到抑制时,hepcidin的表达也显著下降,同时,神经元下降的FPN和升高的Tf R也被逆转。脊髓组织Western Blot结果同样显示,SCI后My D88 f/f组和My D88 CKO组hepcidin都明显上调,然而,与My D88 f/f SCI组相比,My D88 CKO SCI组脊髓hepcidin表达受到明显抑制。相应的,在My D88 f/f小鼠中,SCI后表现为FPN的下降和Tf R的升高。但在My D88 CKO SCI小鼠中,与My D88 f/f小鼠相比,FPN的和Tf R的改变同样被显著逆转。结论:SCI急性期神经元发生铁死亡,伴随邻近的小胶质细胞活化和My D88信号通路激活的结果提示SCI引起的小胶质细胞活化与神经元铁死亡之间的密切关系。细胞培养实验证明了小胶质细胞促炎性活化能促进神经元在OGD/R基础上进一步发生铁死亡。抑制小胶质细胞My D88表达可以明显抑制神经元铁死亡发生,证明小胶质细胞介导的My D88信号在神经元铁死亡中发挥关键作用。TMEM119-Cre ERT;My D88~(flox/flox)转基因小鼠特异性敲除小胶质细胞My D88能够显著下调SCI急性期神经元铁死亡基因,明显促进SCI后运动功能恢复,从而用在体实验证明了小胶质细胞My D88信号的上调在SCI后促进脊髓神经元铁死亡,而下调小胶质细胞My D88信号可减轻神经元铁死亡。小胶质细胞My D88信号与神经元铁死亡的互作主要由IL-1β/hepcidin/FPN轴调控。本研究为SCI中神经元铁死亡的调控机制提供了新的认识,可望为未来治疗SCI提供新的思路和靶点。

番茄(Solanum lycopersicum)是我国栽培面积较大的蔬菜之一,其侧枝是一个重要的农艺性状,直接决定植物的形态结构。过多的侧枝往往会争夺营养分配和采光,降低土地利用率,并对作物果实的数量、产量以及品质产生不良影响,还易引起各种病害。在番茄的栽培生产过程中,由于番茄的分枝能力较强,侧枝生长旺盛,无论利用传统栽培管理还是智能机械化管理,都要定期对番茄的侧枝进行管理,整枝打杈已经成为番茄栽培中最耗时耗力的管理环节。选育少侧枝番茄品种是解决问题的重要途径之一,然而,目前在番茄的种质资源库中暂未发现少侧枝或者无侧枝的品种。前人研究发现,黄瓜Cs PIN3(PIN-FORMED3)基因、苹果Md WUS(WUSCHEL)基因和番茄Sl Sde1A(Super determinant1A)基因功能缺失引起的突变可以抑制黄瓜、苹果以及番茄侧枝的生长。基于这些发现,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将番茄中的Sl PIN4、Sl WUS、Sl Sde1A基因进行敲除,以期获得少侧枝的番茄种质资源。本研究主要获得了以下研究结果:1.敲animal biodiversity除Sl PIN4、Sl Sde1A两个基因对番茄侧枝的生长有抑制作用,而敲除番茄Sl WUS基因后,对侧枝的生长没有抑制作用。2.获得的番茄T_0代、T_1代slpin4和slsde1a突变体,侧枝数量相较于野生型(VE-822 IC50WT)植株数量均Entinostat分子量减少,获得了少侧枝的番茄种质材料,达到了预期效果。获得的番茄slwus突变体T_0代侧枝数量未发生变化,但节间变短、植株矮小,开花后花柱扁平且无花粉。3.通过对番茄slpin4突变体T_1代进行检测并测序,获得1株未携带Cas9蛋白的番茄株系,且该株系侧枝数量相较于野生型数量减少,即为非转基因的基因编辑番茄种质材料。

磺胺甲恶唑(SMX)作为一种广谱性抗生素,广泛应用于Liver biomarkers诸多感染性疾病的治疗中,但因其潜在的生态威胁,已经受到政府和环境领域研究人员Apoptosis抑制剂的广泛关注。目前抗生素处理工艺多选择高能耗或可能产生二次污染的物理化学去除方法。近期研究发现,微生物在好氧情况下,可以产生胞外活性氧(ROS),Antineoplastic and I抑制剂实现对难降解有机污染物的高效去除,但关于该过程对SMX的降解性能以及微生物作用下活性氧产生及防御机制仍不清晰。本研究设计了一种希瓦氏菌(Shewanella Oneidensis MR-1)介导的类芬顿反应,用于自催化生成胞外活性氧,以降解磺胺甲恶唑。研究发现该体系在菌浓为109 cell/mL的情况下,最大降解速度达到38.3μM/L,在48h内高效降解SMX,且可以在15个周期内高效运行。根据量子化学计算及LC-MS/MS测试结果推测了 SMX三种可能的降解路径:去苯氨基作用、S-N键断裂及乙酰化作用。其中去苯氨基作用和S-N键断裂作用位点与羟基自由基攻击的活性位点相同,是自由基攻击的结果;而乙酰化作用中反应开始于异恶唑环的裂解,可能是S.O.MR-1菌株生物降解SMX的结果。ECOSAR毒性分析结果表示,降解过程中的多数中间产物毒性相比于磺胺甲恶唑毒性显著降低,但仍需注意过程中苯系物的生成。基因组注释结果显示,希瓦氏菌中存在大量产活性氧相关基因及抗氧化应激基因。转录组测序结果显示,产活性氧的相关基因中,编码L-氨基酸氧化酶的nadB基因表达在生物类芬顿组中显著上调,编码NADH氧化还原的酶(nqr1、nuo和nqr2)也在生物类芬顿组和无Fe(Ⅲ)对照组中普遍表达,表明希瓦氏菌产生胞外活性氧是NADH氧化还原酶与L-氨基酸氧化酶共同作用的结果。KEGG富集分析结果表示,S.O.MR-1首先通过分泌胞外多聚物作为第一道防线,保护细胞膜免受活性氧的氧化作用;同时利用酶性抗氧化剂(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)及非酶抗氧化剂(谷胱甘肽和γ-氨基丁酸)共同抵御氧化应激。胞外高活性氧浓度使得S.O.MR-1同时启动了活性氧抗性机制。本研究探索了希瓦氏菌介导的类芬顿反应对SMX的降解性能,分析了胞外活性氧产生及抗氧化应激机制,为难降解有机污染物的微生物强化降解工艺开发提供了技术支持与理论依据。

高香型茶树品种一直深受育种工作者和种植生产者关注,其产品深受消费者青睐。‘春闺’是‘黄旦’自然杂交而成的高香型茶树新品种,其制成的乌龙茶滋味醇爽,具有类似茉莉花的特殊香气。目前关于春闺乌龙茶的研究集中在生化成分或低通量香气检测方面,高通量代谢组结合分子层面解析春闺乌龙茶加工过程中的风味品质形成机制的研究鲜有报道。本研究以春闺乌龙茶加工过程样为材料,利用代谢组学技术系统分析春闺乌龙茶加工过程中代谢物的动态变化,结合转录组学构建了春闺乌龙茶加工中滋味、香气与基因之间的共表达网络,挖掘出风味品质相关的关键调控基因,探讨春闺特征风味物质在加工过程中的形成和转录调控,为春闺乌龙茶加工工艺优化和新品种推广研究提供参考。主要结果如下:1.春闺乌龙茶加工过程中滋味物质动态变化研究利用广泛靶向代谢组学技术从春闺闽北乌龙茶加工过程样中检测出31个类别共1060个代谢物,其中黄酮类、酚酸类、氨基酸及其衍生物和脂质是最主要的代谢物类型。结合多元统计分析和倍数差异分析,从春闺乌龙茶加工过程中筛选出660个差异代谢物。功能富集分析表明与茶叶滋味品质形成相关的氨基酸生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、苯丙烷生物合成通路被多次显著富集。差异代谢物动态变化分析表明,在春闺乌龙茶加工过程中,氨基酸含量总体呈上升趋势,L-组氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-亮氨酸等氨基酸含量在做青阶段显著增加并达到峰值。柚皮素、圣草酚、芹菜素等类黄酮物质在春闺乌龙茶加工中含量升高,EC、C、EGC、GC、EGCG等儿茶素单体含量降低。有机酸、脂质此网站、核苷酸和茶黄素类物质在加工中含量显著增加。水杨酸、丁香酸等酚酸类和D-蔗糖、木糖醇等糖类物质含量在干燥工序达到峰值。2.春闺乌龙茶加工过程中香气物质动态变化研究采用挥发性代谢组学技术对春闺闽北乌龙茶加工过程中的香气物质进行测定,共鉴定出10个类别的220个香气物质,以醇类、酯类、烯烃类为主。香气总含量在做青结束后达到最高水平。从加工过程样中筛选出的25个关键香气物质呈现出3种变化趋势:具有花果香的橙花叔醇、吲哚、香叶醇等物质含量在乌龙茶萎凋或做青阶段达到峰值;具有青草气的乙酸叶醇酯、3-己烯-1-醇等物质含量随加工工序呈下降趋势;苯甲醇、苯乙醇、γ-己内酯等物质含量在加工过程中波动上升,干燥后达到峰值。根据相对气味活性值(ROAV)和香气特征影响值(ACI)筛选出芳樟醇、香叶醇、吲哚、茉莉酮、γ-己内酯和α-法呢烯作为构成春闺乌龙茶“品种香”的关键香气物质。其中具有茉莉花香的吲哚(ROAV=186.54,ACI=3.07%)和茉莉酮(ROAV=142.83,ACI=2.35%)是赋予春闺乌龙茶特殊茉莉花香的关键成分,萎凋和做青是促进二者含量积累的关键工序。3.春闺乌龙茶加工过程中差异基因表达模式分析对春闺闽北乌龙茶加工中酶促氧化阶段样品进行转录组测序,鉴定出17256个差异表达基因。GO注释表明大量差异基因注释到代hepatocyte size谢和刺激响应的生物过程,以及催化活性、结合等分子功能条目。KEGG富集分析表明差异基因主要富集在苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成,以及与香气合成直接相关的萜类合成途径。转录因子分析结果显示MYB、ERF、WRKY、b HLH、NAC等转录因子家族对春闺乌龙茶加工过程中风味物质形成具有潜在的调控作用。春闺与黄旦品种鲜叶转录组数据比较结果表明,与吲哚和萜类香气形成相关的ASA1、PAT1、TSB2和DXS、DXR、NES、TPS等关键基因在春闺中的表达量显著高于黄旦。与类黄酮等滋味物质形成相关的ANR、ANS、LAR、DFR、FLS、C4H、CHI、CHS、F3H、F3’H等基因表达量极显著低于黄旦。4.春闺乌龙茶加工中特征风味物质形成转录调控分析通路分析表明,类黄酮合成途径上游关键基因PAL和C4H在春闺乌龙茶做青中后期显著上调,调控L-苯丙氨酸和肉桂酸含量在做青阶段达到峰值。编码黄酮醇和儿茶素生物合成的关键基因CHS、CHI、FLS、DFR、LAR、ANR在萎凋和做青中后期下调最为显著,引起儿茶素等类黄酮物质含量PLX4032体内降低。NES、LIS、GES等萜类香气合成关键基因在春闺萎凋后显著上调,相应的香气物质橙花叔醇、香叶醇同步增加。吲哚合成相关的色氨酸合成酶基因TSB1和TSB2在萎凋工序大量表达,做青后期显著降低,但仍维持极高的表达水平。茉莉酸信号转导途径基因(JAR、COI1、MYC2)在萎凋工序显著上调,在做青工序显著下调,其中MYC2转录因子与TSB1和TSB2具有相似的表达模式。利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建了春闺乌龙茶加工中滋味、香气与基因之间的共表达网络,筛选得到2个WRKY、3个MYB、3个ERF、3个NAC和ARF、DBB、GRAS、GRF、MYB＿related、SBP共17个转录因子以及5个结构基因GGPS、NES、TSB2、JMT、CHS,这些关键枢纽基因在萜类挥发物、吲哚、茉莉酮、类黄酮等风味物质的生物合成中具有潜在的调控作用,从而影响春闺乌龙茶鲜醇滋味和茉莉花香的特征风味形成。

目的：基于肿瘤蛋白53cancer precision medicine(tumor protein 53,p53)/溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member11,SLC7A11/xCT)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4,GPX4)通路探讨疏肝祛瘀解毒方（SGQYJDF）诱导铁死亡抑制裸鼠肝癌增殖。方法：通过将人肝癌细胞株SK-Hep-1注射Baricitinib作用于裸鼠右腋皮下，建立异种皮下移植瘤模型，成模后分为模型对照组、SGQYJDF低、中、高剂量组和SGQYJDF中剂量联合Sorafenib组，按分组连续灌胃14 d，期间观察裸鼠肿瘤体积；灌胃14 d后，测量肿瘤质量并计算生长抑制率，采用HE染色观察各组肿瘤组织病理学变化；比色法检测各组肿瘤组织内丙二醛（malonWnt-C59体内实验剂量dialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）和亚铁离子（ferrous ions,Fe2+）水平；免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）检测各组肿瘤组织内增殖标志物（Kiel 67antigen,Ki-67）及GPX4表达；免疫荧光法（immunofluorescence,IF）检测肿瘤组织内p53和xCT的表达；Western blot法检测p53、xCT和GPX4的表达水平。结果：（1）在肿瘤增殖方面，通过观察裸鼠肿瘤体积及质量并计算生长抑制率，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量相关性的降低肿瘤体积（P<0.01），抑制肿瘤质量增长（P<0.01），各组肿瘤组织均未见明显浸润，同时通过IHC观察计算肿瘤组织内Ki-67阳性细胞率可知，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量相关性降低肿瘤组织Ki-67阳性细胞率（P<0.01），抑制其增殖能力；（2）在铁死亡生化指标方面，通过检测计算相对含量，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量依赖性提高肿瘤组织内Fe2+含量和MDA含量，同时降低GSH的含量（P<0.01）;(3)在蛋白表达方面，通过IHC、IF与Western blot实验，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量相关性地上调p53(P<0.05)的表达，同时抑制xCT(P<0.05)和GPX4(P<0.01)的表达。此外，在实验结果中，我们发现人体等效量的SGQYJDF与Sorafenib联用，其效应高于两倍人体等效量的SGQYJDF。结论：提示SGQYJDF可能通过上调裸鼠皮下移植瘤p53的表达、抑制xCT和GPX4的表达从而诱导其发生铁死亡，抑制其增殖。

蜡梅(Chimonanthus praecox(L.)Link)是中国特产的传统名贵观赏花木,花色丰富,有着悠久的栽培历史和花文化,具有极佳的观赏特性、文化价值和应用前景。以3个蜡梅品种(‘金颜帘卷’、‘美人醉’和‘笑靥’)的5个时期(蕾期、萌动期、初花期、盛花期和末花期)的中被片、内被片为研究对象,综合分析3个品种开花过程中花色表型数据、花瓣表皮细胞形态和生理生化特征的变化,及3个品种盛花期的差异,运用相关性分析与主成分分析,探究蜡梅品种花色变化的规律及花色变化与生理变化之间的关系,以期能为3个品种的花色改良、品种分类等提供参考依据。主要研究结果如下:(1)随着花色变化,3个品种的花色变化幅度不一致。‘金颜帘卷’的中被片、内被片相较于‘美人醉’、‘笑靥’花色变化幅度较小,且三者的内被片变化比中被片更加显著;‘金颜帘卷’的中被片、内被片由黄绿色转为黄色,除a*以外的色度值均减小;‘美人醉’的中被片、内被片由Ceralasertib体内带有红晕arbovirus infection的黄绿色转为黄色,内被片a*显著减小;‘笑靥’中被片由带有红晕的黄绿色转为黄色,b*不断减小;‘笑靥’内被片红色逐渐减淡,a*显著减小。(2)3个品种的花瓣表皮细胞形态均成扁平状,与花色变化无明显相关,但是不同时期细胞的大小、表皮纹路有一定的差别;蕾期到末花期,花衰老且花瓣表皮细胞水分流失,导致中部凹陷,细胞与细胞之间的边界更清晰;3个品种的花瓣表皮细胞均有蜡质乳突和覆盖物。(3)3个品种的中被片、内被片均有类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素,有红晕花被片的‘美人醉’和‘笑靥’品种含有花色苷,3个品种的花色素均以类黄酮居多。类黄酮、类胡萝卜素含量对黄色变化具有显著的影响,花色苷含量对红色变化具有显著的影响。(4)3个品种的可溶性蛋白对类黄酮、类胡萝卜素和花色苷的合成均有一定的促进作用,对花色苷合成促进有更加显著的效果;‘金颜帘卷’和‘笑靥’的中被片可溶性糖与类胡萝卜素、叶绿素呈显著正相关,对花色变化具有一定的影响,但对花色苷的合成并无明显促进作用;‘美人醉’和‘笑靥’的中被片、内被片SOD对其花的衰老具有一定的缓解作用,但对‘金颜帘卷’并无明显作用;‘美人醉’内被片和‘笑靥’的中被片、内被片蕾期花GSK2118436纯度色苷含量最高,其pH值最低,即低pH条件下花色苷稳定性更强,含量更高;‘金颜帘卷’花被片pH越高,黄色越明显。(5)3个品种的PAL、CHI活性均在开花前期的活性更高,色素合成代谢较活跃,因此蕾期和萌动期花色素含量较高。PAL、CHI活性与类黄酮、花色苷含量呈显著正相关,其活性越高越利于花色素的合成,且对花色苷的促进作用更加显著;PAL、CHI活性对3个品种的花色变化均有影响,但CHI活性与色度值之间的相关系数高于PAL,对花色变化的影响更加显著。(6)综合相关性分析和主成分分析说明,影响‘金颜帘卷’的中被片和内被片、‘美人醉’和‘笑靥’的中被片花色变化的主要花色素为类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素;影响‘美人醉’和‘笑靥’的内被片花色变化的主要花色素为花色苷、类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素,但花色苷含量的变化起着最直接的作用;可溶性蛋白、可溶性糖、植物pH、SOD、PAL和CHI等在花色变化的过程中也起到了重要的作用。关于蜡梅后续的花色改良和育种等方面,除了直接改变花色苷、类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素的含量,也可以通过影响花被片细胞中蛋白和糖的含量、调节细胞液pH,或改变酶活性等方式,影响花被片中的花色素含量,达到花色改良的目的。