目的:非小细Crizotinib胞肺癌(NSCLC)是发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一,在NSCLC中,KRAS突变是常见的致癌驱动因素之一。KRAS突变状态与NSCLC免疫治疗临床预后可能存在相关性,本研究旨在探索KRAS突变状态对Ⅲ-Ⅳ期NSCLC患者免疫治疗疗效及预后的影响,探讨KRAS突变状态与临床特征的相关性以及KRAS突变亚型与免疫治疗预后的相关性。方法:收集2017年1月至2022年1月期间在新疆医科大学附属肿瘤医院确诊并行二代基因测序(NGS)的所有NSCLC患者的临床资料,将其中符合selleck NMR入排标准的NSCLC患者纳入研究。基于分子谱和临床特征,分析KRAS突变状态对NSCLC患者治疗效果的影响。结果:疗效分析显示KRAS突变型患者的客观缓解率(ORR)高于KRAS野生型(66.7%vs38.5%,P<0.05),差异有统计学意义。经过生存分析发现接受免疫治疗的KRAS突变型和KRAS野生型患者的平均PFS分别为7.9个月和3.7个月,差异有统计学意义(P=0.01),两组平均OS分别为18.1个月和12.2个月,差异有统计学意义(P=0.003);KRAS突变患者免疫治疗vs化疗的PFS及OS差异均有统计学意义(P=0.01;P=0.039);KRAS G12C突变vs KHereditary anemiasRAS非G12C突变亚型患者接受免疫治疗的PFS、OS均无统计学差异(P=0.982;P=0.866);KRAS G12C突变患者免疫治疗vs化疗的PFS、OS均无统计学差异(P=0.051;P=0.479);KRAS G12D突变vs KRAS非G12D突变患者中接受免疫治疗后的PFS有统计学意义(P=0.005),而OS没有统计学差异(P=0.23);均接受免疫治疗且有吸烟史的KRAS突变型患者vs KRAS野生型患者的PFS、OS及免疫治疗后KRAS突变吸烟者vs非吸烟者的PFS、OS均有统计学差异(P<0.05);均接受免疫治疗的KRAS和TP53共突变及KRAS和KMT2C共突变患者分别与单独KRAS突变及KRAS野生型患者相比,其PFS、OS均具有统计学意义(P<0.05)。结论:在接受免疫治疗的患者中,KRAS突变患者对免疫治疗更敏感,将会有更好的预后;KRAS G12C突变亚型不影响免疫治疗结果;KRAS和TP53共突变以及KRAS和KMT2C共突变对免疫治疗反应可能会改善。
去甲基化药物治疗骨髓增生异常综合征1个疗程后血小板数倍增对治疗反应及疗效的预测价值
目的:探讨去甲基化药物(HMA)治疗1个疗程后血小板数倍增(血小板计数加倍)对骨髓增生异常综合征(MDS)治疗反应及疗效的预测价值。方法:收集2017年1月1日至2022年3月31日就诊于徐州医科大学附属医院接受单用去甲基化药物治疗的75例MDS患者临床及随访资料。根据MDS患者治疗1个疗程后血小板数是否加倍分为血小板倍增组和血小板非倍增组，并进行组间数据统计分析，比较两组间治疗反应及疗效。此外，还比较了患者血小板的变化在阿扎胞苷和地西他滨治疗中的差异。结果:血小板倍增组在治疗3个INCB018424 NMR疗程后ORR明显优于非倍增组(P=0.002),两组获血液学改善的病例数差异有显著统计学意义(P=0.005)。此外，血小板倍增组和非倍增组患者的中位生存期(MST)分别为26和11个月(P=0.001)。血小板倍增组的总生存期(OS)、1及2年OS率也明显优于血小板非倍增组。多变量COX回归分析结果显示，在治疗1个疗程后血小板数倍增是MDS患者OS的独立预测因子(P=0.013)。阿扎胞苷治疗MDS患者血小板数倍增的反应此网站率与地西他滨相比差异无统计学意义(33.3%vs 23.8%,P>0.05)。结论:zebrafish-based bioassays治疗1个疗程后血小板数倍增可作为MDS患者去甲基化药物治疗反应率和较长OS的预测指标。此外，用阿扎胞苷和地西他滨治疗MDS患者血小板数倍增的反应率无明显差异。
艾曲波帕对难治性原发免疫性血小板减少症的疗效及其对细胞免疫功能的影响（英文）
探讨艾曲波帕在难治性原发免疫性血小板减少症(ITP)治疗中Imidazole ketone erastin纯度的临床效果及其对细胞免疫功能的影响。选取2019年1月至2022年10月我院收治的132例难治性ITP患者纳入研究,将其分为联合治疗组(44例)、单一治疗组(44例)和对照组(44例),联合治疗组给予艾曲波帕联合长春地辛治疗,单一治疗组给予艾曲波帕单药治疗,对照组仅给予生活方式干预治疗,疗程均为12周。比较三组临床疗效及不良反应,检测治疗前后三组血小板计数(PLT)、出血时间(BT)、T淋巴细胞亚群(CD_4~+、CD_8~+)、B淋巴细胞亚群(CD_(19)~+、CD_(20)~+)、Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2)及Th2细胞因子(IL-5、IL-4)水平变化。治疗后,单一治疗组完全反应率明显高于对照组,联合治疗组完全反immune surveillance应率明显高于单一治Trichostatin A体内疗组(均P<0.05)。单一治疗组治疗总有效率高于对照组(P <0.05);联合治疗组总有效率高于单一治疗组(P <0.05)。与对照组比较,单一治疗组治疗后PLT及BT检测值均明显改善(P <0.05);与单一对照组比较,联合治疗组治疗后PLT及BT检测值均明显改善(P <0.05)。与对照组比较,单一治疗组治疗后CD_4~+/CD_8~+及CD_(19)~+/CD_(20)~+均明显改善(P<0.05);与单一治疗组比较,联合治疗组治疗后CD_4~+/CD_8~+及CD_(19)~+/CD_(20)~+均明显改善(P﹤0.05);与对照组比较,单一治疗组及联合治疗组治疗12周后血清IFN-γ、IL-2水平明显较低,而血清IL-5、IL-4水平明显较高(P <0.05);与单一治疗组比较,联合治疗组治疗12周后血清IFN-γ、IL-2水平明显较低,而血清IL-5、IL-4水平明显较高(P <0.05);三组不良反应发生率比较无显著差异(P> 0.05)。对于难治性原发免疫性血小板减少症患者,艾曲波帕与免疫抑制剂联合治疗安全有效,利于细胞免疫功能恢复。
肺癌与肠道菌群结构特征的相关性研究
目的:研究肺癌患者肠道菌群的特征,探索肠道菌群与肺癌发生发展的关系,为肺癌的诊治提供新的思路。研究对象与方法:根据入排标准纳入2021年8月至2022年6月在河北医科大学第四医院呼吸科就诊,病理诊断明确的肺癌患者,共61名。并记录临床特征,将肺癌患者按病理类型分成鳞癌组(SCC)、腺癌组(A C)和小细胞肺癌组(SCLC);依据TNM分期将患者分为I-II期组、III期组和IV期组;根据远处转移器官个数将患者分为0个组(M0)、1个组(M1)、2个组(M2)和3个组(M3);根据基因检测结果将患者分为EGFR突变组和EGFR野生组;根据患者接受化疗联合免疫治疗的疗效分为PR组和SD组。获取患者入院后第一天清晨的粪便,对粪便进行16s r RNA检测,通过建库测序,分析鳞癌组、腺癌组和小细胞肺癌组;I-II期组,III期组和IV期组;M0组、M1组、M2组和M3组;EGFR突变组和EGFR野生组;PR组和SD组等不同组别的患者肠道菌群的组成、多样性、肠道菌群分布差异。筛选出与肺癌病理类型、基因突变、转移等临床特征相关的菌群,探索化疗联合免疫治疗疗效相关的菌群生物标志物。结果:1.入组患者一般情况:(1)病理类型分组中,SCC组、AC组、SCLC组三组在性别、吸烟史、TNM分期上存在显著差异(P<0.05),SCC组中男性占比(100%)远多于AC组(53.1%)和SCLC组(74.4%),SCC组中有吸烟史的人数(90.9%)明显多于AC组(40.6%)和SCLC组(57.1%),SC LC组中IV期的患者(100%)明显多于SCC组(66.7%)和AC组(81.8%);在年龄、BMI、PD-L1表达上无显著差异(P>0.05)。(2)以TNM分期组中,I-II期组、III期组、IV期组三组在病理类型上存在明显差异(P=0.008),I-II期组中鳞癌的比例(100%)明显大于III期组(20%)和IV期组(15%);在性别、年龄、BMI、吸烟史、TNM分期、PD-L1表达上无显著差异(P>0.05)。(3)以远处转移器官个数分组中,M0组、M1组、M2组、M3组在TNM分期上有明显差异(P<0.01),M1组、M2组和M3组中IV期的患者明显多于M0组(100%vs100%vs100%vs0%);在性别、年龄、吸烟史、BMI、病理类型、PD-L1表达上无明显差异(P>0.05)。(4)以EGF R突变与否分组中,EGFR突变组和ERFR野生组两组在吸烟史上存在显著差异(P=0.047),EGFR突变组中无吸烟史的占比(69.2%)明显高于EGF R野生组(34.8%);在性别、年龄、BMI、病理类型、TNM分期、PD-L1表达上无明显差异(P>0.05)。(5)以化疗联合免疫治疗疗效分为PR组和SD组,两组在性别、年龄、吸烟史、BMI、病理类型、TNM分期、PD-L1表达上均无明显差异MCC950生产商(P>0.05);2.肠道菌群门水平物种组成情况:(1)在接受化疗联合免疫治疗的患者中,PR和SD两组患者的粪便标本中均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)为主,但PR组中变形菌门(Proteobacteria)丰度明显高于SD组(P<0.05),PR组中厚壁菌门(Firm icutes)丰度明显低于SD组(P<0.05)。(2)在SCLC中厚壁菌门(Firmicu tes)含量较SCC、AC高,但无统计学差异(P>0.05),变形菌门(Prote obacteria)含量在SCLC中最低,亦无统计学差异(P>0.05)。(3)依据T NM分期分组分析,TNM分期越晚变形菌门(Proteobacteria)含量越少,但无统计差异(P>0.05)。(4)远处转移器官数分组中,M0、M1、M2、M3四组间的物种组成无显著差异(P>0.05)。(5)EGFR突变组中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)相对丰度较EGFR野生组高(P>0.05),相反,拟杆菌门(Bacteroidota)丰度较低(P>0.05)。3.α多样性分析:(1)远处转移器官个数分组中,M0组的ACE指数(P=0.049)、Chao1指数(P=0.048)显著高于M3组,且远处转移器官数越多,ACE指数和Chao1指数越低。(2)AC组的α多样性指数(ACE指数、Chao1指数)低于SCC组和SCLC组(P>0.05)。(3)随着TNM分期越晚,α多样性(ACE指数、Chao1指数)逐渐下降(P>0.05)。(4)EGFR突变型的α多样性指数(ACE指数、Chao1指数)低于EGFR野生型,但无统计学差异(P>0.05)。(5)在接受化疗联合免疫治疗的患者中,PR组的α多样性指数(ACE指数、Chao1指数)高于SD组,但无统计学差异(P>0.05)。4.β多样性分析:在本研究中,病理类型分组(SCC组、AC组、SCL C组)、TNM分期分组(I-II期组、III期组、IV期组)、远处转移器官数分组(M0组、M1组、M2组、M3组)、EGFR分组(EGFR突变组、EGFR野生组)和化疗联合免疫治疗的疗效分组(PR组、SD组),基于unweighted Uni Frac、weighted Uni Frac方法,以上分组之间β多样性均无统计学差异(P>0.05)。5.组间差异分析:我们进一步分析各分组的菌群,筛选出不同组间的特异性生物标志物。(1)SCC组的特征性菌群在纲水平为γ-变形菌纲(c＿Gammaproteobacteria);SCLC组的特征性菌群在属水平为g＿Eubacterium＿Ventriosum＿group和g＿Ruminococcus＿torques＿group,在种水平为s＿unclass ified＿Eubacterium＿Ventriosum＿group和s＿unclassified＿Ruminococcus＿torque s＿group。(2)TNM分期I-II期的患者肠道特征性菌群在属水平为未分类普雷沃氏菌属(g＿unclassified＿Prevotellaceae),在种水平为s＿Bacteroides＿st ercoris和未分类普雷沃氏菌种(s＿unclassified＿Prevotellaceae);III期的患者特征性肠道菌群在种水平为s＿uncultured＿prokaryote。(3)M1组的特异性菌群在种水平为s＿uncultured＿rumen＿bacterium;M3组的特异性菌群在种水平为s＿Fusobacterium＿mortiferum。EGFR突变型的患者特征性肠道菌群在属水平为未分类肠杆菌属(g＿unclassified＿Enterobacteriaceae),在种水平为未分类肠杆菌种(s＿unclassified＿Enterobacteriaceae)和s＿unculture d＿Veillonellaceae＿bacterium;(4)EGFR野生型的患者肠道特征性菌群在目水平为乳杆菌目(o＿Lactobacillales),在科水平为链球菌科(f＿Streptoc occus)和f＿Barnesiellaceae,在属水平为链球菌属(g＿Streptococcus)、g＿Lachnospiraceae＿UCG＿010、萨特氏菌属(g＿Sutterella)、g＿Bamesiella,在种水平为s＿unclassified＿Bamesiella、s＿uncultured＿Roseburia＿sp、s＿Ligilact obacillus＿salivarius、未分类链球菌种(s＿unclassified＿Streptococcus)、s＿u nclassified＿Lachnospiraceae＿UCG＿010。(5)PR组的特征性肠道菌群在门水平为变形菌门(p＿Proteobacteria),在纲水平为γ-变形菌纲(c＿Gamma proteobacteria),在目水平为肠杆菌目(o＿Enterobacterales),在科水平为肠杆菌科(f＿Enterobacteriaceae)和f＿Defluviitaleaceae,在属水平为埃希氏志贺菌属(g＿Escherichia＿Shigella)和g＿Defluviitaleaceae＿UCG＿011,在种水平为未分类埃希氏确认细节志贺菌种(s＿unclassified＿Escherichia＿Shigella)、s＿Bacteroides＿eggerthii、s＿Parabacteroides＿gordonii、s＿Ruminococcus＿calli dus、s＿unclassified＿Defluviitaleaceae＿UCG＿011;SD组的患者特征性肠道菌群在门水平为厚壁菌门(p＿Firmicutes)和p＿Myxococcota,在目水平为o＿Pilyangiales、乳杆菌目(o＿Lactobacillales),在科水平为f＿Carnobacteri aceae和链球菌科(f＿Streptococcceae),在属水平为链球菌属(g＿Streptoco ccus),在种水Medical pluralism平为s＿Streptococcus＿anginosus、s＿unclassified＿Granulicatell a、s＿Megasphaera＿micronuciformis、s＿unclassified＿Actinomyces、未分类链球菌种(s＿unclassified＿Streptococcus)。结论:1.在接受化疗联合免疫治疗的患者中,疗效达到PR的患者肠道变形菌门丰度明显增高,厚壁菌门丰度显著降低。2.随着远处转移器官数越多,肠道菌群α多样性越低。3.在不同类型的分组中,肠道中均存在各自特征性的菌群生物标志物。
SMYD2通过调控SLC39A10/P53轴介导膀胱癌铁死亡的机制研究
[目 的]本课题旨在:1.利用生物信息学方法筛选与膀胱癌进展和预后相关的关键基因;2.明确SMYD2在膀胱癌中的生物学作用;3.运用转录组高通量测序技术(RNALY-188011抑制剂-sequencing,RNA-seq)和染色质易接近性测序技术(Assay for Targeting Accessible-Chromatin using high-throughput sequencing,ATAC-seq)探索敲低SMYD2后,膀胱癌细胞基因表达谱以及染色质易接近性的变化,以寻找其下游关键基因;4.探究SMYD2在膀胱癌中的分子调控机制,为膀胱癌的早期诊断和分子靶向治疗提供新的思路。[方 法]1.综合生物信息学方法分析识别与膀胱癌进展和预后相关的关键基因(1)从高通量基因表达(Gene expression omnibus,GEO)数据库中下载膀胱癌基因芯片数据集(GSE133624)并在癌症基因组图谱(The cancer genome atlas,TCGA)数据库中获取膀胱癌转录组数据和相应临床资料,使用R包“limma”分析TCGA数据和GEO数据中膀胱癌患者的差异基因。(2)利用加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis,WGCNA)对差异基因进行共表达分析,筛选得到两个数据集的关键模块基因,再取两个关键模块基因的交集作为与膀胱癌进展相关的关键模块基因。然后利用套索算法(Least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)和支持向量机递归特征消除法(Support vector machine recursive feature elimination,SVM-RFE)筛选特征基因,选取两种算法筛选得到基因的交集基因作为候选特征基因。(3)为了探究候选特征基因的表达对膀胱癌患者预后的影响,通过基因表达谱交互分析(Gene expression profiling interactive analysis,GEPIA2)验证关键基因的转录表达情况,利用Kaplan-Meier单因素生存分析鉴定与膀胱癌预后相关的关键基因,最后,将正常样本和肿瘤样本间基因表达呈显著差异同时生存也呈显著差异的基因确定为特征基因。(4)利用TCGA数据集做免疫浸润分析,旨在探讨特征基因与免疫细胞的相关性。利用单样本基因集富集分析(Single sample gene set enrichment analysis,ssGSEA)对28个肿瘤浸润性淋巴细胞的基因标记在TCGA数据集每个样本中的免疫活性进行打分,根据免疫活性打分矩阵,通过hclust聚类把样本分成高免疫组(Immunity_H)、中等免疫组(Immunity_M)和低免疫组(Immunity_L),探讨特征基因的表达在不同免疫活性分组中的差异性,利用Spearman相关性分析特征基因与免疫细胞的相关性。(5)对特征基因做基因探针富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA),探索其潜在的生物学功能。此外,通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)、免疫印迹(Western Blot,WB)、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)验证特征基因在膀胱癌中的表达情况。2.SMYD2在膀胱癌中的生物学作用(1)利用细胞转染技术构建干扰和过表达SMYD2膀胱癌稳定转染细胞株,并通过荧光显微镜观察转染效率,利用RT-qPCR和WB进行最佳干扰筛选和表达效率检测。(2)通过CCK-8实验、Edu细胞增殖检测法、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验分别探究SMYD2在体外对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。(3)通过建立裸鼠皮下成瘤模型研究过表达或干扰SMYD2在体内对膀胱癌生长的影响。3.联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找SMYD2的靶基因(1)构建低表达SMYD2的稳定转染J82膀胱癌细胞株,应用RNA-seq筛选SMYD2干扰前后显著变化的基因。(2)应用ATAC-seq检测SMYD2敲低前后细胞染色质易接近性的变化。(3)对SMYD2敲低前后的RNA-seq和ATAC-seq数据进行一系列生物信息学分析,寻找膀胱癌中受SMYD2调控的潜在下游关键基因。(4)通过RT-qPCR和WB实验检测敲低和过表达SMYD2的膀胱癌细胞株中SMYD2下游基因的差异表达情况。4.探究SMYD2在膀胱癌中的分子调控机制(1)构建P53过表达载体和SLC39A10干扰慢病毒载体,分别转染膀胱癌细胞株,并用RT-qPCR和WB检测转染效率。(2)通过回复实验研究SMYD2下游基因SLC39A10和P53对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。同时,检测膀胱癌细胞中铁死亡相关指标的变化情况。(3)体内生物学功能回复实验进一步验证SMYD2影响膀胱癌的作用机制。[结 果]1.综合生物信息学分析鉴定膀胱癌进展和预后标志物(1)共筛选出189个与膀胱癌进展相关的差异基因,进一步通过LASSO回归分析联合SVM-RFE分析,筛选出14个关键基因(C1QTNF7,ATP1A2,FXYD1,CFD,LGI4,ACTA2-AS1,PER1,THSD4,SMYD2,CILP,ESM1,ULBP2,NMB 和 GAPDHP1)。(2)总生存期分析结果显示肿瘤样本中高表达的SMYD2、GAPDHP1和低表达的ATP1A2、CILP、THSD4对患者总生存期有影响。5个特征基因与临床病理因素的相关性分析表明,它们在膀胱癌的进展中发挥着重要作用。(3)差异下调基因ATP1A2、CILP、THSD4与大多数免疫细胞呈显著正相关,而差异上调基因SMYD2只与两类免疫细胞呈显著负相关,GAPDHP1与大多数免疫细胞呈显著负相关。(4)RT-qPCR结果显示在膀胱癌组织和膀胱癌细胞系中SMYD2、GAPDHP1显著上调,ATP1A2、CILP、THSD4显著下调,与TCGA和GEO数据库中的结果一致。(5)WB和IHC结果均显示SMYD2在膀胱癌组织中显著上调。2.SMYD2的体内外功能验证(1)成功构建过表达载体并筛选出sh-SMYD2-1为最佳干扰载体。(2)sh-SMYD2可以显著降低J82细胞株的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力,sh-SMYD2虽然可以降低J82细胞的划痕愈合能力,但却不显著。(3)OE-SMYD2可以显著提高T24细胞株的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力,OE-SMYD2虽可以提高T24细胞的划痕愈合能力,但却不显著。(4)体内实验结果表明过表达SMYD2可以促进膀胱癌肿瘤的生长,敲低SMYD2的表达可以抑制膀胱癌肿瘤的生长。3.联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找SMYD2的下游靶基因(1)应用RNA-seq筛选出了敲低SMYD2后表达显著差异的基因有4420个,其中上调2405个,下调2015个。(2)ATAC-seq 显示 GainDAR 中 Distal Peak 有 56 个关联基因;GainDAR 中Proximal Peak有207个关联基因;LossDAR中Distal Peak有27个关联基因;LossDAR 中 ProximalPeak有205个关联基因。(3)RNA-seq和ATAC-seq数据联合分析发现染色质可及性增强且表达上调的基因有 6 个,分别是 TRIM36、ADRB2、MAML1、CD274、ZNF438、KDSR;染色质可及性减弱且表达下调的基因有8个,分别是PRDX1、CTH、FLJ46875、SLC39A10、CALD1、LOC105375905、RAD54B、JRKL。(4)RT-qPCR和WB结果显示SLC39A10在SMYD2敲低的膀胱癌细胞株中显著下调,在SMYD2过表达的细胞株中显著上调Food biopreservation,与测序结果一致。(5)基因功能富集分析找到了 SLC39A10基因所富集的代谢通路,显示其在铁死亡通路中富集。4.体内外验证SMYD2通过SLC39A10/P53轴诱导铁死亡影响膀胱癌的进展(1)RT-qPCR和WB检测结果提示P53过表达载体构建成功以及P53过表达T24细胞株转染成功;(2)SMYD2、SLC39A10和P53的细胞回复实验及细胞功能检测结果提示,SMYD2和SLC39A10的表达水平均与细胞增殖能力、克隆形成能力、划痕愈合能力和细胞侵袭能力呈正相关,P53的表达水平和细胞增殖能力、克隆形成能力、划痕愈合能力和细胞侵袭能力呈负相关;(3)SBMN 673半抑制浓度MYD2、SLC39A10和P53的细胞回复实验及铁死亡相关指标检测结果提示,SMYD2和SLC39A10的表达与ROS水平、MDA、LPO、总铁离子、Fe2+和GSSG含量呈负相关,与NADPH含量和GSH/GSSG水平呈正相关;P53的表达与ROS水平、MDA、LPO、总铁离子、Fe2+和GSSG含量呈负相关,与NADPH含量和GSH/GSSG水平呈正相关。[结 论]1.SMYD2、GAPDHP1、ATP1A2、CILP和THSD4是膀胱癌进展和预后相关的关键基因,可作为膀胱癌临床治疗和预后预测的潜在生物标志物。本研究通过一系列生物信息学分析鉴定了膀胱癌中具有预后价值的基因,为膀胱癌患者的治疗提供了新的依据。2.SMYD2的表达与膀胱癌细胞的增殖、克隆形成、迁移、侵袭和划痕愈合能力呈正相关;SMYD2的表达和膀胱癌肿瘤的生长呈正相关。3.基于染色质易接近性的变化和转录水平的研究发现:敲低SMYD2基因对膀胱癌细胞株中染色质的开放情况有较大的影响,且影响SMYD2调控的下游基因SLC39A10的表达。4.SMYD2通过调控SLC39A10和P53的表达抑制铁死亡进而促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
5-ALA-PDT通过ROS诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞铁死亡及其机制的研究
瘢痕疙瘩是一种genetic reversal纤维增生性疾病,通常由烧伤、创伤或感染后伤口的异常愈合导致,其特征是成纤维细胞增殖增加以及细胞外基质过度沉积。患者临床表现常有瘙痒、疼痛和外观畸形,严重者可伴有出血、溃疡和感染,极度影响患者的生活质量。瘢痕疙瘩表现出许多肿瘤性的特征,包括不受控制的侵袭性生长、高复发率以及与肿瘤相似的生物能量学。基于5-氨基乙酰丙酸的光动力疗法(5-ALA-PDT)是一种已经用于临床治疗瘢痕疙瘩的有效治疗方法,其原理主要通过产生活性氧物质(ROS)来介导细胞毒性作用。铁死亡是一种新型的细胞死亡模式,以致命的铁依赖性脂质过氧化为特征,受到多种细胞代谢过程的调节,包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活性、氨基酸代谢等。在脂质过氧化和铁死亡过程中,ROS也是一个关键因素。本课题以人正常皮肤组织和瘢痕疙瘩组织以及从中提取的成纤维细胞为研究对象,主要探讨了5-ALA-PDT是否能诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生铁死亡,以及其中可能涉及的潜在机制。这为进一步理解PDT治疗下瘢痕疙瘩成纤维细胞中的氧化应激状态和细胞死亡过程奠定了基础,也为临床上通过铁死亡途径促进5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩的治疗效果提供了新的思路。一、5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞的效应及最佳实验参数的筛选:1.对离体组织和原代细胞的鉴定:HE染色显示,相较于正常皮肤,瘢痕疙瘩真皮层中粗大的胶原纤维较多,排列复杂紧密,细胞数量较高。波形蛋白免疫组化染色结果显示,提取的原代细胞波形蛋白阳性,实验中所提取、培养的原代细胞为较高纯度的成纤维细胞。2.5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞毒性作用:CCK-8结果显示,ABT-199核磁在5-ALA浓度0-8mM和光照强度0-80www.selleck.cn/products/Cisplatin J/cm~2的范围内,5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞活力抑制呈5-ALA浓度和光照强度依赖性,且在8mM和80 J/cm~2达到最大。3.5-ALA在瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化为PpIX:通过荧光显微镜观察,随着5-ALA浓度的增加,荧光显微镜下的PpIX荧光强度随之增强。4.5-ALA-PDT在瘢痕疙瘩成纤维细胞中诱导ROS的产生:在相同能量密度的光照下,4mM组的ROS荧光强度明显高于1mM组;在同样的5-ALA浓度下,ROS荧光强度呈光照强度依赖性,且在32J/cm~2达到最高。5-ALA-PDT诱导产生ROS的趋势与铁死亡诱导剂Erastin诱导产生ROS的趋势相似。二、5-ALA-PDT诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞铁死亡:1.5-ALA-PDT处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞中的差异性表达基因:mRNA测序分析显示5-ALA-PDT处理后瘢痕疙瘩成纤维细胞中显著上调的基因包括PTGS2和ATF3,提示可能涉及铁死亡。2.Western Blot结果显示,相较于正常皮肤成纤维细胞,细胞周期蛋白CCND1和铁死亡相关蛋白GPX4、xCT在瘢痕疙瘩成纤维细胞中高表达,5-ALA-PDT可抑制该趋势。3.5-ALA-PDT诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞的铁死亡:通过试剂盒检测发现5-ALA-PDT可升高瘢痕疙瘩成纤维细胞内Fe~(2+)、脂质过氧化物、丙二醛的水平,其趋势与铁死亡诱导剂Erastin相似;而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的预处理可以逆转5-ALA-PDT的该趋势。透射电镜下观察相较于对照组,5-ALA-PDT和Erastin处理组瘢痕疙瘩成纤维细胞内线粒体呈现铁死亡的特征性改变,即线粒体固缩,体积变小,线粒体膜及基质密度增大,线粒体嵴减少。4.Western Blot结果显示,5-ALA-PDT对瘢痕疙瘩成纤维细胞高表达CCND1、GPX4、xCT的抑制作用与Erastin处理后的趋势相似,且Ferrostatin-1的预处理可以逆转5-ALA-PDT的该趋势。综上所述,我们发现5-ALA-PDT导致瘢痕疙瘩成纤维细胞中ROS和脂质过氧化水平升高,并伴有抗铁死亡蛋白xCT和GPX4下调。这些结果表明,5-ALA-PDT可能通过增加ROS,同时抑制xCT和GPX4,从而促进脂质过氧化并诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞发生铁死亡。
替格瑞洛促进Ⅰ型成骨不全小鼠骨形成的治疗研究
目的 探索替格瑞洛(Ticagrelor)促进Ⅰ型成骨不全小鼠(Col1a1~(+/-365))骨形成的效果及作用机制。方法 选取6只8周龄野生C57/BL小鼠作为正常对照组(WT),选取12只8周龄Comechanical infection of plantl1a1~(+/-365)小鼠，随机分为DMSO此网站对照组和替格瑞洛治疗组，每组6只，通过灌胃给药[2 mg/(kg·d)]进行治疗，DMSO对照组每天灌胃同等剂量DMSO。10周后分离各组小鼠的股骨，通过Micro-CT检测股骨骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)等参数的变化；采用HE染色检测股骨形态学变化；采用Trap染色检测破骨细胞的数量变化；采用Real-time PCR法检测股骨破骨特异基因Mmp9、Ctsk、Nfatc1的表达情况。结果 (1)与DMSO对照组比较，Ticagrelor治疗组BV/TV、Tb.N、Tb.Th和骨面积(B.Ar)均增高(P<0.05),而Tb.Pf降低(P<0.05)。Ticagrelor治疗组小鼠与WT组小鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Th差异无统计学意义(P>0.05);(2)与DMSO对照组比较，Ticagrelor治疗组破骨细胞数量减少(P<0.05),破骨特异基因Mmp9、Nfatc1表达水平降低(P<0.05)。结论 替格瑞洛可以有效改善Col1a1~(+/-365)小鼠的股骨微观结构，促进骨形成，其机制SB431542分子式可能与抑制破骨细胞分化相关。
替格瑞洛促进Ⅰ型成骨不全小鼠骨形成的治疗研究
目的 探索替格瑞洛(Ticagrelor)促进Ⅰ型成骨不全小鼠(Col1a1~(+/-365))骨形成的效果及作用机制。方法 选取6只8周龄野生C57/BL小鼠作为正常对照组(WT),选取12只8周龄Comechanical infection of plantl1a1~(+/-365)小鼠，随机分为DMSO此网站对照组和替格瑞洛治疗组，每组6只，通过灌胃给药[2 mg/(kg·d)]进行治疗，DMSO对照组每天灌胃同等剂量DMSO。10周后分离各组小鼠的股骨，通过Micro-CT检测股骨骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)等参数的变化；采用HE染色检测股骨形态学变化；采用Trap染色检测破骨细胞的数量变化；采用Real-time PCR法检测股骨破骨特异基因Mmp9、Ctsk、Nfatc1的表达情况。结果 (1)与DMSO对照组比较，Ticagrelor治疗组BV/TV、Tb.N、Tb.Th和骨面积(B.Ar)均增高(P<0.05),而Tb.Pf降低(P<0.05)。Ticagrelor治疗组小鼠与WT组小鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Th差异无统计学意义(P>0.05);(2)与DMSO对照组比较，Ticagrelor治疗组破骨细胞数量减少(P<0.05),破骨特异基因Mmp9、Nfatc1表达水平降低(P<0.05)。结论 替格瑞洛可以有效改善Col1a1~(+/-365)小鼠的股骨微观结构，促进骨形成，其机制SB431542分子式可能与抑制破骨细胞分化相关。
基于红景天苷对三阴性乳腺癌关键差异基因作用机制的生物信息学和分子对接技术分析
目目的的：通过生物信息学和网络药理学方法探讨红景天苷治疗三阴性乳腺癌（TNBC）的作用机制，阐明其产生治疗作用的主要靶点和信号通路。方法：通过基因表达综合数据库（GEO）获取数据集GSE45827，利用R软件包GSEABase进行基因集富集分析（GSEA），采用limma R软件包寻找相邻正常组织和TNBC组织之间Emergency medical service的差异表达基因（DEGs），对DEGs进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析，将DEGs与药物靶点结合，导入基因/蛋白相互作用检索搜查工具String数据库，形成蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。使用MCODE插件对PPI网络进行功能模块筛选，对SCORE值排名前2位的关键模块基因再次进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。将2次KEGG富集分析所得通路与转录组数据GSEA富集分析结果取交集，获得红景天苷治疗TNBC的作用通路。使用CytoHubba插件计算出关键模块中最大团中心性（MCC）评分前10位的关键节点基因，即为核心基因。应用AutoDockVina1.1. 2和PyMOL2.3. 0软件完成分子对接。结果：KEGG与GSEA富集分析的结果取交集得到13条共同通路，涉及细胞周期、细胞衰老和p53信号通路等。GO功能富集分析结果中所涉及的有丝分裂、核分裂和姐妹染色单体分离等生物学过程与细胞周期有密切关联，与KEGG富集分析结果一致。SCORE值排名第1位的关键模块中包含5个红景天苷药物作用靶点，分别为重组人细胞周期蛋白A2 (CCNA2)、细胞周期检查点激酶1 (CHEK1)、驱动蛋白家族成员11 (KIF11)、DNA拓扑异构酶2 (TOP2A)和胸腺嘧啶酸合酶（TYMS），将上述蛋白与红景天苷进行分子对接，结果均表现出很强的结合能力（结合能<-7.0 kcal·mol-1selleck LGX818）。结论：红景天苷的紧密结合靶标位于TNBC的DEGs关键功能模块中，可以与CCNA2蛋白结合产生直接的调控作用，与KIF11、TOPA2、CHEselleck BAY 73-4506K1和TYMS蛋白结合可针对TNBC的关键节点基因产生间接的调控作用，红景天苷有可能成为TNBC的临床治疗药物。
松嫩平原部分地区氟含量调查及其对禽类毒性效应的研究
氟(Fluoride,F)是人体必PLX4032配制需微量元素之一,在日常生活和野外环境中十分常见,其主要通过呼吸、饮食、饮水等途径对机体造成损伤。在野外环境中,很多地区都存在氟超标的现象,对周边地区人群以及动物植物造成很大危害。氟超标会引起禽类肝脏、大脑等器官出现严重的病理损伤和超微结构变化,例如炎性浸润、产生大量出血点、线粒体损伤等。铁死亡是近年来新提出的一种细胞死亡方式,其主要表现为铁积累、脂质过氧化、线粒体膜增厚以及活性氧的产生等。中性粒细胞外捕网(Neutrophil external traps,NETs)是一种中性粒细胞活化机制,其过度积累会导致炎症的加强。然而到目前为止,氟导致的组织损伤是否与铁死亡有关以及氟导致NETs形成的机制尚不明确。为了阐明上述问题,本试验首先对松嫩平原内的自然保护区:龙凤湿地自然保护区、查干湖自然保护区的水体和底泥以及向海自然保护区水体中的氟含量进行了检测。之后本研究将120只1日龄的罗斯308肉鸡随机分为4组,每组30只,基于环境样品检测的氟离子浓度以及毒理学浓度,确定四组日粮中NaF的浓度,饲养周期为42天。分别在日粮中添加不同浓度的NaF使对照组(C组)、低氟组(LF组)、中氟组(MF组)、高氟组(HF组)的日粮中氟离子的浓度分别为0、500、1000、2000mg/kg,用以复制野外氟中毒禽类模型。采用H&E染色、透射电镜观察、转录组学和代谢组学联合分析、油红O染色、免疫组化、实时荧光定量PCR、免疫印迹、流式细胞术等方法确定氟引起禽类肝脏损伤的具体机制。之后在体外使用鸡胚原代肝细胞和LMH细胞加以验证。采用荧光染色、细胞活力检测、实时荧光定量PCR、免疫印迹、添加氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、铁死亡抑制剂(Fer-1)、钙离子通道抑制剂硝苯地平(Nifedipine)等手段对氟引起鸡外周血NETs的具体机制加以探究。通过检测脑组织中趋化因子的表达、NETs的生成情况、建立中性粒细胞和神经元细胞共培养体系等方式,以期阐明氟引起的NETs在脑部炎症中的作用。研究结果如下:(1)对龙凤湿地自然保护区的7个采样地点进行了氟含量检测发现,水体中的氟离子浓度为0.9-1.47mg/L,平均值为1.16mg/L,略高于国家标准1mg/L。底泥中的氟离子含量为287-759mg/kg,平均值为502mg/kg,略高于中国土壤背景值480mg/kg。在对查干湖自然保护区检测中发现12个水体采样点的氟离子浓度为0.91-1.47mg/L,平均值为1.24mg/L,8个底泥采样点所检测出的氟离子浓度为408-945mg/kg。向海湿地8个水体采样点中的氟离子含量为三个地区中最高,为2.17-3.26mg/L,平均值为2.47mg/L。结果显示松嫩平原部分地区存在环境中氟超标的现象。(2)F中毒禽类体重降低,肝脏脏器系数增加,肝功能降低。油红O染色显示肝脏中脂质积累随浓度增加而减少。组织病理学观察显示随着F浓度的增加肝脏出血点增多,出现炎性细胞浸润。超微结构观察显示MF组和HF组均出现线粒体结构异常和空泡化。采用转录组学和代谢组学联合分析发现FOXO信号通路、谷胱甘肽代谢异常、鞘脂代谢、神经活性配体-受体相互作用等途径有显著变化。之后检测了肝脏组织中铁积累情况以及氧化应激相关标志物(T-AOC、CAT、MDA、GSH)的水平。采用qRT-PCR以及WB从转录和翻译水平对FOXO信号通路、氧化应激相关通路、铁死亡相关因子进行检测。发现F可以使肝脏中铁含量升高,发生氧化应激,激活FOXO信号通路、Nrf2信号通路导致铁死亡的发生。在体外试验中采用原代鸡肝细胞以及LMH细胞通过CCK-8、qRT-PCR、WB、铁离子和ROS荧光染色、流式细胞术等手段发现氟可以在体外引起肝细胞以及LMH细胞FOXO通路激活,并且引起氧化应激的发生和铁积累的现象,引起铁死亡。另外氟也可以引起细胞周期阻滞在S期,使DNA合成受阻,导致细胞死亡。(3)首先采用不同剂量的NaF(0m M、0.25m M、0.5m M、1m M)诱导NETs生成,再与佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)的诱导效果进行对比筛选出体外诱导NETs的最佳剂量。之后采用qRT-PCR的方法对NETs形成相关基因(MPO、NE、H3、NOX-2、PKCα、PKCβ、PKCζ)进行转录水平的检测,采用WB和免疫荧光对MPO、NE进行了蛋白水平的检测,结果发现NaF诱导鸡外周血NETs的最适浓度为1m M。随后采用Hoechst染色观察NETs的生成情况,Fe Rh Nox-1探针观察NETs形成过程中Fe~(2+)的积累情况,以及采用Fer-1和NAC处理观察谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的变化。结果发现Fer-1能明显减Antiviral medication少NaF诱导的NETs生成,但不能减少PMA诱导的NETs的产生,NAC对于PMA和NaF均有抑制抑制作用。此外在NaF诱导NETs的形成过程中观察到了Fe~(2+)的积累,这种积累可以被Fer-1所缓解,而在PMA作用下并未观察到此现象。GSH和MDA的检测结果显示Fer-1和NAC可以缓解NaF所引起GSH下降和MDA升高。(4)Fer-1的预处理会抑制NETs生成相关指标(MPO、NE)和铁死亡相关指标(GPX4、SLC7A11、FTH1、NCOA4、ALOX12)的基因和蛋白的表达,但是Fer-1不会缓解NaF所导致的线粒体去极化。接下来采用Fluo-4AM钙离子荧光探针对NaF作用下中性粒细胞Ca~(2+)积累情况加以检测,结果发现NaF会使中性粒细胞内Ca~(2+)含量上升,但是Fer-1并不能挽救这一现象。采用L-型钙离子通道(LTCC)抑制剂硝苯地平(Nifedipine)预处理中性粒细胞,发现Nifedipine可以通过抑制LTCC相关蛋白的表达(p-CAMKII、CAMKII、CACNA1D)降低NaF引起的Ca~(2+)增加以及铁死亡的发生。通过线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测线粒体膜电位,WB和Hoechst染色检测铁死亡相关因子和NETs的生成情况发现,Nifedipine可以缓解线粒体去极化现象,并且通过减少铁死亡的方式降低NETs生成相关蛋白的表达。(5)对不同浓度下NaF诱导的大脑组织进行了H&E染色和透射电镜观察,发现有炎性浸润和线粒体损伤的情况出现。接下来对趋化因子(CCL1、CCL4、CCL17、CSCL12、CXCL13、CXCL14)进行检测,结果表明在NaF作用下脑组织中会募集中性粒细胞。之后对脑组织进行铁死亡、NETs和LTCC相关指标检测发现NaF会引起脑组织发生铁死亡并且脑组织中LTCC开放,NETs生成也增多。最后构建了中性粒细胞和原代神经Naporafenib体内实验剂量元细胞共培养模型,发现NaF可以通过引起NETs的方式加重神经元细胞的炎症反应。综上所述,松嫩平原部分地区存在氟超标的现象,高氟日粮会引起禽类肝脏发生铁死亡从而造成肝脏损伤,转录组学和代谢组学联合分析发现,NaF通过SIRT1/FOXO3通路诱导肝脏铁死亡,体外采用原代肝细胞以及LMH细胞对此结论进行了验证。另外过量的NaF可以通过引起中性粒细胞铁死亡的方式诱导NETs的生成,并且加强了脑部的炎症反应。本研究的创新点是首次将野外氟含量调查与实验室模型相结合,开展环境毒理学相关的研究,其次通过多组学联合分析的手段将氟中毒与铁死亡和肝脑轴的调控进行相关检测。并且首次从铁死亡的角度探讨氟对机体的损伤机制,并对NaF引起NETs的生成原因加以探讨,为氟诱导机体损伤提供了重要理论依据和数据支持,丰富了氟相关的生物学内容。