ALK抑制剂

目的:探索肝素剂量对体外循环心脏手术患者术后出血的影响,为临床实践和合理实施个体化用药提供有力依据,减少心脏手术围Galunisertib化学结构术期出血从而达到改善患者预后和术后转归。方法:选择全身麻醉下实施体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)心脏外科手术的成年患者共137例。将患者按首次公斤体重给予的肝素剂量分为三组:①低剂量组(初始肝素剂量<300 IU/kg,n=39);②中剂量组(初始肝素剂量300IU/kg～450IU/kg,n=50);③高剂量组(初始肝素剂量>450IU/kg,n=48);分别记录各组患者术后24小时内胸腔引流量和围术期输血量等指标,详细记录一般资料、手术及预后相关资料并进行比较。结果:三组患者术后24小时内出血量具有显著性差异(p<0.05),接受高剂量肝素患者术后出血明显高于低剂量组患者,高剂量组患者术中输注浓缩红细胞、术后输注新鲜血浆量增加(p<0.05)。组间两两相互比较得知,手术患者的术后24小时内出血量、术中浓缩红细胞输注量及术后新鲜血浆量输注量:高剂量组>中剂量组>低剂量组,差异具有统计学意义(p<0.05)。高剂量组患者术后输血人数比例和严重出血比例明显上升(p<0.05)。结论:术中高剂量肝素的使用会增加患者术后出血的风险,也会提高对术中及术后血液制selleckchem LEE011品的输注需求,不利于病人的预后和转归。低剂量肝素较高剂量肝素相对安全,有利于改善患者疾病预hepatic tumor后和减轻术后出血等并发症。故术中避免使用高剂量肝素,积极采用最低有效剂量并合理实施个体化用药,加强体外循环心脏手患者术围术期血液保护。

目的 通过网络药理学及生Proteases抑制剂物信息学技术探讨益气化瘀解毒方治疗慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructivepulmonarydisease，COPD）的潜在作用机制。方法 采用TCMSP和TCMIP数据库检索益气化瘀解毒方的活性成分及靶点；经GeneCards、TTD、DrugBank、OMIM、DisGeNET数据库等筛选COPD疾病靶点，并于基因表达综合数据库（GEO）中下载并分析芯片GSE130928和GSE5058数据集，筛选出COPD患者与健Orthopedic infection康人的差异基因；运用Venny2.1平台获取复方与疾病的交集靶点（关键靶点），导入Cytoscape3.9.1软件分析复方治疗COPD的核心活性成分；通过STRING数据库构建蛋白互作（PPI）网络并得出该网络的核心靶点；借助Metascape数据库对共同selleck合成靶点及差异基因进行GO及KEGG功能富集分析；运用AutodockTools和Pymol软件将核心靶点蛋白与核心活性成分进行分子对接加以验证。结果 本研究共得到益气化瘀解毒方176个活性成分，中药靶478个，疾病靶点15256个，关键“方-病”靶点400个；益气化瘀解毒方治疗COPD的核心活性成分包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、黄芩黄酮II、异鼠李素等；PPI网络中潜在核心靶点有MAPK3、AKT1、TP53、MAPK1、HSP90AA1、JUN等；GO富集分析得到生物学过程（BiologicalProcess，BP）948个、细胞组成（CellularComponent，CC）121个和分子功能（MolecularFunction，MF）164个，条目主要分布于氧化应激、营养代谢、细胞膜结构及蛋白结合活性等内容；KEGG通路富集分析主要涉及AGE-RAGE、cAMP、NF-κB信号通路等，与炎症、氧化应激、新陈代谢关系密切。分子对接结果均显示结合所需能量较低，亲和力较强，能形成稳定构象。结论 本研究初步探讨了益气化瘀解毒方治疗COPD的潜在作用机制，表明该方具有多成分-多靶点-多通路的药效特点，将为今后相关研究提供新的思路和依据。

为探索柱花草(Stylosanthes guianensis)根系分泌物对缺磷胁迫的响应，本研究以‘热研5号’柱花草为材料，通过水培试验，分析了正常供磷(+P)和缺磷(-PBioprinting technique)处理对柱花草生长及根系分泌物的影响。结果确认细节表明，相对于+P处理，-P处理显著降低了柱花草植株干重和全磷含量。随后，代谢组共检测到101个根系分泌代谢物，可被分为有机酸、氨基酸、类黄酮、糖及醇类等七类，RP56976抑制剂其中-P与+P处理间的差异累积代谢物25个。属于有机酸的咖啡酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸在-P处理下的分泌量显著增加，且其中α-酮戊二酸对磷酸铝具有较强的溶解能力。此外，荧光定量PCR分析发现，柱花草根系中参与α-酮戊二酸合成的柠檬酸脱氢酶基因SgICDH在-P处理下的表达量显著增加。因此，柱花草根系通过上调SgICDH基因的表达，促进α-酮戊二酸的合成与分泌，从而增强对难溶性磷的活化利用，以适应缺磷胁迫。

咖啡、红茶是全球范围内极受欢迎的饮品。得益于独特的风味、香气和有益于健康的功效,咖啡、红茶饮品在世界范围内的消费总量激增。然而,伴随着加工及消费总量的不断提高,咖啡渣、红茶渣这类热饮副产品的产量的也在急剧增加。据统计,全球每年将会产生数以百万吨计的咖啡渣、茶渣副产品。长期以来,咖啡渣、红茶渣被视作低价值材料而被随意丢弃,由此导致类似于填埋或焚烧等处置方法不仅将直接导致生物质资源的损失,而且在此过程中对生态环境和人体健康产生的危害同PEG300试剂样不容忽视。目前,已有研究表明,咖啡渣、红茶渣含有丰富的营养物质以及生物活性成分,具有抗氧化、消炎、抗菌和抑制肿瘤等功能特性,同时还可作为一种成本低廉、易于获得的天然生物着色selleck NMR剂来源,在纺织品染色整理上具有潜在的应用价值。羊毛、蚕丝等蛋白质纤维对天然染料具有良好的亲和力。然而,在对于棉纤维染色时具有一定的局限性,染色性能较差。这主要是因为,棉织物表面的高负电荷密度与带负电的阴离子天然染料存在库仑斥力,导致纤维与染料难以结合。因此,在对棉纤维进行天然染料染色时,有效的方法之一是尽量减少排斥作用力。在这项工作中,充分探究了咖啡、红茶热饮副产物在羊毛、蚕丝和棉织物染色和功能整理领域的应用,主要研究内容和结论如下:(1)实验使用环保提取工艺,研究了溶剂提取体系因素对咖啡渣、红茶渣天然染料提取效果的影响,并对咖啡渣、红茶渣染料粉末进行热重分析、傅里叶红外光谱分析、表面形貌分析和元素组成进行分析,同时评估了提取后咖啡渣、红茶渣废料用于植物土壤肥料的可行性。结果表明,最佳提取条件为:采用乙醇/碱溶剂体系控制液料比为50:1,在50%乙醇溶液中加入少许质量分数为5%的碳酸氢钠溶液调至p H=8,并在温度为80°C条件下提取60 min。就红茶渣染料提取而言,对比乙醇溶剂、酸溶剂、乙醇/酸溶剂、碱溶剂和乙醇/碱溶剂五种溶剂体系,在乙醇/碱溶剂体系下提取染料的类黄酮含量最高。紫外吸收光谱和傅里叶红外光谱分析证实了在乙醇/碱溶剂体系下咖啡渣、红茶渣提取物中存在咖啡因植物生物碱化合物、类黄酮以及多酚类物质。热重分析表明,咖啡渣和红茶渣中天然染料在最佳提取条件下具有良好的热稳定性,并适用于纺织品染整工艺。通过对土壤以及土壤与提取后咖啡渣、红茶渣加工废料的混合物进行p H分析评估,表明其可最终作为植物肥料安全回归土壤并使植物获益,为减少咖啡渣、红茶渣宝贵资源的填埋提供了一种可持续性的处置方法,在一定程度上了实现废料的回收循环利用。(2)将咖啡渣、红茶渣天然染料应用于羊毛、蚕丝织物染色,并对染整羊毛、蚕丝织物的K/S值、色牢度、抗氧化、紫外线防护性能和抗菌活性进行表征。结果表明,经咖啡渣、红茶渣染料染整后的羊毛、蚕丝织物呈现出不同程度的棕色色调,具有较好的染色性能。其中,当织物类型相同时,红茶渣染料上染织物的K/S值大于咖啡渣。染整织物的各项色牢度均符合工业规模要求。通过染色可将咖啡因、类黑精、儿茶素、多酚和类黄酮等多种生物活性物质高效转移到羊毛、蚕丝织物上,SEM图像证实了咖啡渣、红茶渣天然染料颗粒在羊毛、蚕丝纤维表面的附着,从而使染整织物具有抗氧化、紫外线防护性能和抗菌活性。本章中咖啡渣、红茶渣天然染料在羊毛、蚕丝织物上的成功染色及功能整理,将拓展热饮副产品在纺织品领域的增值应用。(3)提供了一种绿色环保的棉织物表面改性方法用于提高对天然染料的亲和力。采用环保热水浴从草鱼鱼鳞提取鱼鳞蛋白作为天然阳离子改性剂用于棉织物的染色前改性,同时选用EDTA溶液、柠檬酸和乙酸溶液用于鱼鳞脱矿处理。将咖啡渣、红茶渣天然染料用于鱼鳞蛋白改性棉织物的染色整理,并对鱼鳞蛋白改medical mobile apps性棉织物的染色p H进行优化,通过对棉织物K/S值、SEM扫描电镜、色牢度、抗氧化性能、紫外线防护性能和抗菌活性等表征,分析并探讨了脱矿液种类对鱼鳞蛋白改性、棉织物染色效果以及生物功能的影响。结果表明,与未经鱼鳞蛋白改性后的染整棉织物相比,经鱼鳞蛋白改性后的染整棉织物K/S值均有不同程度的提高。考虑到过低的染浴p H可能会对织物的强度造成损失,最终选择p H=4.8为棉织物染浴的p H值。脱矿处理大大提升了鱼鳞蛋白改性棉织物的效果,结果显示,经脱矿处理后改性得到的染整棉织物K/S值提升最为显著,而不同脱矿液种类处理后改性得到的染整棉织物的K/S值的差异可能与脱矿处理环境的p H值以及脱矿反应产物有关。其中,经EDTA脱矿处理后改性得到的红茶渣染料染整棉织物的K/S值最高,为7.7195。经脱矿处理后,咖啡渣、红茶渣天然染料染整改性棉织物具有良好的耐洗、耐干、湿摩擦和耐光色牢度等级,符合工业规模要求。同时,与对照组相比,脱矿处理后改性得到的染整棉织物紫外线防护性能、抗氧化活性和抗菌活性显著提高,实现了棉织物的生物功能整理。

【目的】优化哈茨木霉UN-2菌株产β-葡聚糖酶的培养基组分及发酵参数，提高其产酶能力，研究β-葡聚糖酶粗酶液Ferrostatin-1试剂对水稻纹枯病病原菌的拮抗作用及田间防效，阐明哈茨木霉菌株UN-2在水稻纹枯病生物防治中的应用潜力。【方法】采用单因素试验考察不同碳源、氮源和金属离子对哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶的影响，利用正交试验确定木霉菌株产β-葡聚糖酶的最适温度、pH、接种量、瓶装量、摇床转速和发酵时间，优化哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶诱导发酵条件；通过体外拮抗试验和田间防效试验研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病的抑菌防病作用。【结果】哈茨木霉菌株UN-2发酵产β-葡聚糖酶最佳碳源和氮源分别为麦麸和硫酸铵，金属离子Ca~(2+)和Mg~(2+)对木霉产β-葡聚糖酶活性具有明显的促进作用。哈茨木霉UN-2菌株以10.0 g/L麦麸、0.5 g/L β-葡聚糖、4.0 g/L硫酸铵、1.5 mmol/L Ca~(2+)、0.5 mmol/L Mg~(2+)为培养基，在温度3Intra-abdominal infection2 ℃、起始pH 6.5、接种量8 mL（10~(6 )cfu/mL）、瓶装量30 mL/250 mL、摇床转速160 r/min条件下发GSK1349572酵64 h获得β-葡聚糖酶活性最高。木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶粗酶液对立枯丝核菌和禾谷丝核菌的菌丝生长和菌核萌发具有明显的抑制作用，对由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病的田间防效达70.45%，与5%井冈霉素处理相当，β-葡聚糖酶粗酶液处理可提高水稻结实率和稻粒充实度。【结论】哈茨木霉菌株UN-2在最优发酵条件下产酶活性达97.68 U/mL，β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病具有较强的抑菌防病效果，并对水稻植株具有一定的促生作用。

目的 探讨南方医科大学深圳医院血小板减少住院患者的科室分布及病因,为临床诊疗提供参考。方法 从医院信息管理系统(HIS)中调取1800例血小板减少患者的临床资料,对患者的年龄与性别,病因、科室分布情况,血小板减少的程度进行回顾性分析。结果 1800例血小板减少患者中位年龄为56岁(1 d～98岁),其中≤60岁患Dinaciclib浓度者1062例,占59.00%;>60岁患者738例,占41.00%。1800例患者中男性993例,占55.17%；女性807例,占44.83%。男性患者中位血小板计数为80×10~9/L,女性患者中位血小板计数为80×10~9/L。1800例患者中血小板计数≤20×10~9/L 121例,占6.72%；血小板计数(20～50)×10~9/L 274例,占15.22%；血小板计数(51～100)×10~9/L 1405例,占78.06%。1800例血小板减少患者主要分布在血液科、肝病科、重症医学科、肿瘤科、普通外科等科室,其中血液科占19.39%,中位血小板计数为50×10~9/L。1800例血小板减少患者中血液系统疾病共399例,占比22.17%；肝脏疾病346例,占比19.22%；肿瘤300例,占16.67%；感染性疾病297例,占16.50%；心脑血管疾病134例,占7.44%；肾病78例,占4.33%；妊娠期血小板减少41例,占2.28%；内分泌疾病27例,占1.50%；其他疾病178例,占9.89%。血液系统疾病平均血小板计数为50.58×10~9/L,肝脏疾病平均血小板计数为72.93×10~9/L,内分泌疾病平均血小板计数为74.5Empagliflozin体内6×10~9/L,肿瘤患者平均血小板计数为75.immunity support10×10~9/L,心脑血管疾病平均血小板计数为75.73×10~9/L,肾脏疾病平均血小板计数为77.01×10~9/L,感染性疾病平均血小板计数为78.05×10~9/L,其他疾病平均血小板计数为80.65×10~9/L,妊娠期血小板减少平均血小板计数为83.10×10~9/L。其中血液系统疾病患者平均血小板计数最低,且与其余8种疾病患者两两比较,差异有统计学意义(P<0.001)；肝脏疾病患者平均血小板计数与其他疾病患者比较,差异有统计学意义(P<0.01)；其余疾病患者两两比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 2021年度住院患者血小板减少的主要病因为血液系统疾病、肝病、肿瘤和感染性疾病,其中血液系统疾病患者血小板减少程度最为严重,需要临床重点关注,其他系统疾病引起的血小板减少也需临床高度重视。

魔芋葡甘聚糖(KGM)溶液具有优良的承载和润滑能力，为研究其微观作用机理，采用分子动力学模拟的方法，阐明了魔芋葡selleck合成甘聚糖水合层的形成过程，探讨其在模拟工况下(压力范围：0～1000 MPa、剪切速度范围：0.02～1 nm/ps)的承载能力及剪切特性，揭示了其润滑机理.模拟结果表明，魔芋葡甘聚糖分子与水分子通过氢键形成水合分子，由于吸附效应，水合分子向铁原子层表面吸附聚集构成水合层作为承压MK-1775临床试验载体；在剪切作用下，界面处吸附的魔芋葡甘聚糖水合分子层削弱了水分子与铁原子层的相互作用，从而降低界面剪切应力；魔芋葡甘聚糖分子数过多时，液相层中间部位的魔芋葡甘extra-intestinal microbiome聚糖浓度增加，造成其周围液相层流动阻力增大，导致界面剪切应力增大.随着剪切速度的增加，KGM与水分子间的氢键随之减弱，从而削弱了KGM水合分子对水分子的约束，导致界面剪切应力随剪切速度的增大而增大.

目的 探讨利伐沙班对髋膝关节置换术患者术后失血情况、凝血功能、炎症因子、深静脉血栓及并发症发生情况的影响。方法 选取2020年10月至2022年10月无锡市惠山区第三人民医院收治的60例行髋膝关节置换术的患者，以随机数字表法分为对照组（30例）与观察组（30例）。对照组患者术后给予低分子肝素钙注射液治疗，观察组患者术后给予利伐沙班治疗，两组患者均治疗15 d并随访2个月。比较两组患者术中失血量、术后引流量，治疗前与治疗15 d后的凝血功能、炎症因子水平，以及随访期间的深静脉血栓和并发症发生情况。结果 与治疗前比，治疗15 d后两组患者血清降钙素原（PCT）、C-反应蛋白（CRP）水平均显著降低，且与对照组比，观察组患者血清PCT、CRP水平降低幅度更大（均P<0.05）；治疗15 d后两组患者白细胞计数（WBC）水平均降低（均P<0.05），但两组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；两组患者术中失血量与术后引流量比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；两组患者治疗前后组内、组间活化部分凝血活酶时间（APTT）、组织型纤溶酶原激活剂物抗原（tPA-Ag）、血小板计数（PTezacaftor配制LT）、凝血酶原时间（PT）水平比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；观察组患者随访期间的深静脉血栓发生率及并发症总发生率分别为0.00%、3.33%，低于对照组的13.33%、20.00%，但差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 利伐沙班Bioconcentration factor与低分子肝素用于髋膝关节置换术患者，在改善凝血功能，降低术后深静脉血栓及并发症3-MA作用发生率方面效果相当，但利伐沙班更利于降低患者术后炎症反应。

研究背景:核酸,包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),是几乎所有生命形式最重要的生物分子。DNA和RNA在生物的日常代谢活动中起着重要的作用:DNA储存了大量的遗传信息,RNA主要负责调控基因表达。除了基本生理功能外,DNA和RNA也可以用作疾病诊断、监测、个体化治疗以及预后评估的分析目标。切刻内切酶是可以特异性识别并附着特定的核酸底物序列(DNA或RNA),在其特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切刻的一类酶。在本研究中,我们将利用切刻内切酶这一独特的切割方式构建针对核酸靶标的新型生物传感器并探究其实际应用能力。设计具有任意形状和可控运动纳米结构的能力使DNA纳米材料广泛用于构建具有不同结构和功能的各种分子机器,其中DNA walker以其巧妙的设计和灵活的功能成为最受欢迎的分子器件之一。DNA walker可在多维度轨道上渐进自主移动,在生物传感、材料组装与合成、疾病诊断等方面具有广泛的应用前景。在过去几年中,DNA walker从结构设计到生物应用取得了惊人的进展,但其可持续性与速度限制仍然制约着其进一步应用。在本研究中,我们设计了一种切刻内切酶驱动的三维lame DNA walker。这种DNA walker简单、灵巧,增加可持续性的同时保证其高效地自主运动,大幅度提高了以lame DNA walker作为生物传感检测的稳定性及检测速度。恒温指数扩增技术,如指数放大反应(Exponential Amplification Reaction,EXPAR)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)、环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种仅需在恒定温度下就可实现以指数形式扩增核酸靶标的方法。与广泛使用的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相比,等温指数扩增技术无需精确的热循环,因此在便携式检测领域有着极强的吸引力。此外,分析微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA)靶标时,mi RNA的短长度(通常20个碱基左右)使得PCR设计非常复杂。在众多检测mi RNA的等温指数扩增技术中,EXPAR因设计简单,迅速放大能力强而受到广泛关注。然而,EXPAR对于微量mi RNA的检测应用依然受到模板序列依赖的掣肘。为了解决这个问题,本研究充分利用EXPAR扩增系统中原有的切刻内切酶成分,以熵驱动元件作为mi RNA靶标的识别元件,从而构建了一种基于切刻内切酶的熵驱动反应启动EXPAR的mi RNA通用、特异检测方法。除如Nb.Bbv CI这种常规的切刻内切酶外,近年来用于基因编辑的切刻内切酶也引起了研究人员的广泛关注。寻找可能有助于基因编辑的酶研究最近将注意力集中在来自原核生物的Argonaute蛋白(Prokaryotic Argonaute proteins,p Agos)。虽然它们是人类Argonaute蛋白的结构同源物,后者使用RNA引导来干扰RNA靶标,但Pf Ago,Tt Ago,Mj Ago等p Agos可使用单链DNA引导来识别并切割互补的DNA或RNA靶标,达到类似常规切刻内切酶的效果。大量证据表明,检测液体活检中循环肿瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ct DNA)中的单核苷酸变异体对于癌症的早期检测或最小残留疾病监测具有独特的益处,但目前临床的ct DNA检测依然面临耗时、操作繁琐以及成本高昂的问题。在本研究中,我们利用新型的Tt Ago基因编辑切刻内切酶偶联EXPAR反应,实现了ct DNA的超迅速、简单、灵敏检测。虽然基于CRISPR-Cas系统(Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins System)的检测方法已经彻底改变了诊断领域,但其因受到PAM或前间隔区侧翼位点(Protospacer Flanking Sites,PFS)的限制以及需要不易保存的RNA作为引导核酸而面临挑战。类似于CRISPR-Cas,p Agos蛋白由于其识别和切割靶序列的能力,已经被提议作为有前途的下一代核酸检测平台,因此p Agos可作为解决CRISPR-Cas所面临挑战的一种很有吸引力的工具酶。但目前已报道基于p Agos的核酸检测平台或与PCR相偶联,或与后续的恒温扩增步骤分离开来,导致难以在恒定温度下一步检测核酸靶标。在本研究中,我们利用Tt Ago蛋白整合高温EXPAR反应,实现了于66°C条件下一步检测任意感兴趣RNA靶标的超灵敏特异检测方法。研究目的:常规切刻内切酶部分:(1)构建切刻内切酶驱动的三维lame DNA walker,增加可持续性的同时保证其高效地自主运动,大幅度提高其作为生物传感检测的稳定性及检测速度。(2)构建一种基于切刻内切酶的熵驱动反应启动EXPAR的mi RNA通用、特异检测方法。新型Argonaute基因编辑切刻内切酶部分:(1)Tt Ago切刻内切酶偶联EXPAR反应,实现循环肿瘤DNA的超迅速、简单、灵敏分析。(2)Tt Ago整合热稳定EXPAR反应构建恒温扩增体系,一步高灵敏、特异检测任意感兴趣RNA靶标。研究方法:1.切刻内切酶启动的lame DNA walker分子机器的构建(1)扫描电镜表征链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球。(2)荧光终点检测证明8个栓子以及14个栓子的lame DNA walker可行性。(3)荧光动力学比较研究单腿DNA walker以及双腿的lame DNA walker。(4)荧光终点检测以及荧光显微镜研究lame DNA walker的可持续性(5)lame DNA walker的性能优化研究。(6)探究lame DNA walker检测单链靶标的灵敏度与特异性。2.切刻内切酶辅助熵驱动元件触发指数扩增反应的一步恒温扩增策略用于micro RNA特异和超灵敏检测研究(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光动力学证明切刻内切酶辅助熵驱动元件的可行性。(2)切刻内切酶辅助熵驱动元件产物触发EXPAR反应可行性研究。(3)切刻内切酶辅助熵驱动元件触发指数扩增反应恒温扩增策略(NAED-EXPAR)可行性研究。(4)NAED-EXPAR的实验条件优化。(5)mi R-21靶标用于标准的EXPAR方法检测。(6)mi R-21靶标用于NAED-EXPAR策略的灵敏度及其特异性分析。(7)NAED-EXPAR与荧光定量PCR(RT-q PCR)分析各细胞系样本mi R-21靶标的性能比较研究。3.Argonaute内切酶偶联指数扩增的循环肿瘤DNA超迅速分析研究(1)Tt Ago基因编辑切刻内切酶的表达、纯化与表征。(2)Tt Ago在不同缓冲溶液中的切割活性研究。(3)Mg~(2+)、SSB以及d NTP浓度对Tt Ago切割活性影响。(4)EXPAR的灵敏度测试。(5)Thermus thermophilus Argonaute偶联指数放大(Tt Ago-CEAR)的实验条件优化。(6)Tt Ago-CEAR的灵敏度与特异性分析。(7)纳米粒子探针的合成。(8)基于太赫兹光谱或横向流试纸条的Tt Ago偶联传感检测ct DNA研究。(9)Tt Ago-CEAR检测不同突变分数ct DNA。(10)Tt Ago-CEAR与ARMS PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR)检测血浆样本的比较研究。(11)小鼠实验验证Tt Ago-CEAR检测肿瘤负担以及监测治疗状况潜能。4.基于Argonaute内切酶的RNA恒温检测平台构建及应用研究(1)PAGE电泳证明Tt Ago酶在65至69°C条件下特异性切割单链RNA的能力。(2)荧光动力学分析Tt Ago酶在65°C条件下特异性切割单链RNA能力。(3)荧光动力学分析各DNA聚合酶与切刻内切酶组合的热稳定EXPAR性能。(4)PAGE电泳以及荧光动力学证明基于Thermus thermophilus Argonaute的恒温扩增(Tt Ago EAR)策略的可行性。(5)Tt Ago EAR策略的实验条件优化。(6)Tt Ago EAR策略的灵敏度测试。(7)Tt Ago EAR与RT-q PCR方法的比较性研究。(8)细胞与组织内RNA以及唾液中病毒RNA的Tt Ago EAR分析。(9)Tt Ago EAR联合横向流试纸条的便携传感分析。研究结果:1.切刻内切酶驱动的三维lame DNA walker在30分钟内显示出60.4的信噪比;动力学研究表明,瘸腿步行器的平均速度可达6.467×10~(-11) M s~(-1);14个碱基的栓子可以使lame核酸催化剂与运动轨道持续保持联系;lame DNA walker的线性检测范围为10p M-5 n M。2.针对mi R-21靶标,标准的EXPAR方法仅能明显检测10 p M的目标物,而NAED-EXPAR可以于60分钟内检测100 a M的目标物;NAED-EXPAR可以识别单个核苷酸变异的mi RNA靶标;NAED-EXPAR检测细胞内mi R-21靶标的RSD(Relative Standard Deviation)值可控制于15%以内,与RT-q PCR两方法线性回归分析的R~2值为0.994selleckchem。3.动力学研究表明Tt Ago在TMSN缓冲溶液(Thermo Pol+Mg~(2+)+SSB+d NTPs)中的ct DNA靶标切割半衰期为2分钟;PAGE研究证明Tt Ago可以于5分钟内在TMSN缓冲溶液中快速切割野生型G12D靶标;Tt Ago-CEAR可以在16分钟内检测低至25 a M的KRAS(Kirsten Rats Arcomaviral Oncogene Homolog)常见突变型G12D靶标,线性检测范围为25 a M-2.5 p M;检测同浓度G12D靶标时,可以不受野生型KRAS,EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor),NRAS(Neuroblastoma RAS Viral Oncogene Homolog)等基因干扰;Tt Ago-CEAR也可以灵敏检测G12V,G12R,G12A,G12S,G12C,G13D六种其他常见的KRAS突变;Tt Ago偶联太赫兹平台检测灵敏度为2.5 a M,便携横向试纸条检测灵敏度为80 a M,均可于20分钟实现ct DNA的快速分析;输入25 f M的总ct DNA,Tt Ago-CEAR可以检测0.3%-100%突变分数的G12D,检测灵敏度低至0.1%;来自Horizon Discovery的血浆样本表明Tt Ago-CEAR的ROC(Receiver Operator CharacteristicGenetic and inherited disorders)准确性(95%)高于常见的ARMS PCR方法(93%);动物实验表明盐水处理组小鼠血浆G12D ct DNA水平与肿瘤体积上升节律一致,吉西他滨化疗组小鼠血浆在18天前G12D ct DNA水平上升幅度明显低于未接受治疗的盐水处理组。4.Tt Ago酶可以在65-69°C条件下特异性识别并切割突变型RNA靶标而不切割野生型RNA;Bst 3.0 DNA聚合酶与Nb.Bts I联合Tt Ago可以实现1 p M靶标RNA检测,其检测阈值与空白样本差异可达65.80±0.99分钟;Tt Ago可以明显影响Tt Ago EAR的分析性能;Tt Ago EAR的检测灵敏度为10 a M-50 a M,其检测结果与RT-q PCR方法检测结果一致性高,回归系数为0.993;相比阴性对照样本,Tt Ago EAR能够明显区分细胞、组织以及唾液样本中的阳性RNA靶标;Tt Ago EAR可以利用2 ng的总RNA材料检测细胞样本中低至0.1%的G12D RNA突变;Tt Ago EAR检测的小鼠血浆G12D RNA水平与小鼠肿瘤负荷状况一致;Tt Ago EAR联合横Barasertib分子式向流试纸条可以便携式检测浓度低至20a M-50 a M的RNA靶标。研究结论:1.与大多数双腿DNA walker的结构不同,lame DNA walker有一条主要负责持续运动的长腿和一条快速切割基质的短腿。这种切刻内切酶驱动的lame DNA walker运行速度快,同时显示出高信噪比,这些性能均比已报道的三维DNA walker明显更具优势。lame DNA walker持续性研究证实了lame核酸催化剂不会脱离运动轨道。此外,提出的瘸腿步行器显示出高灵敏度和特异性的传感检测潜力。这项工作将进一步提高三维DNA walker的性能,并有助于加深对DNA walker系统的理解。2.针对mi R-21靶标,NAED-EXPAR相比标准EXPAR方法检测灵敏度至少高5个数量级,同时具有特异性进一步提升,大幅度提高了检测性能。实际样本表明NAED-EXPAR与RT-q PCR检测结果一致,证明建议方法检测的可靠性。此外,NAED-EXPAR通过一步恒温策略的单管测试增加了检测简便性。目前的研究有助于监测细胞内mi RNA水平和辅助早期癌症诊断。3.TMSN缓冲溶液作为Tt Ago-CEAR的最佳反应缓冲液。构建的方法可以以阿摩灵敏度以及单核苷酸分辨率超迅速分析ct DNA靶标,与常见的ARMS PCR和数字PCR的1-2小时时间相比,Tt Ago-CEAR方法显著缩短了可靠的ct DNA检测所需的时间。鉴于其不需要PAM的较短引导核酸DNA需求,其在检测ct DNA的设计上也非常简单。此外,这种策略还具有监测肿瘤负荷和评估化疗效果的巨大潜力。4.Tt Ago EAR是一种真正的恒温检测方法,其可以于66°C条件下以阿摩灵敏度以及单核苷酸分辨率一步检测RNA靶标。Tt Ago EAR的顺利进行还依赖于Tt Ago的高保真性:除了切割RNA靶标外,Tt Ago还具有促进Tt Ago EAR反应和抑制其非特异性扩增的能力。这也是首次发现Tt Ago作为反应增强剂的例子。Tt Ago EAR能够传感检测不同类型的RNA,包括三种lnc RNAs、一种病毒RNA和一种m RNA,证明Tt Ago切割和热稳定EXPAR偶联的Tt Ago EAR方法的优越性。此外,Tt Ago EAR联合横向流试纸条检测有助于RNA靶标的便携式分析。

目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是全球癌症死亡的第三大原因,每年给人们带来巨大痛苦和损失。目前,肝癌的治疗方式主要是手术结合放化疗,然而目前的治疗措施下患者五年生存率仍然较低。肝癌的发展和转归是肝癌Affinity biosensors细胞与机体免疫相互作用的结果。大多数肝癌患者存在免疫耐受,以及基础肝病引起的慢性炎症,进一步增强了免疫逃逸,使癌细胞得以生长。CD8~+T淋巴细胞是抗肿瘤免疫的主要介质,调节CD8~+T细胞的反应一直是癌症免疫治疗的焦点。当CD8~+T细胞特异性识别主要组织相容性复合体分子(Major Histocompatibility Complex,MHC)呈现的抗原肽时,它们能被激活并杀死肿瘤细胞。事实上,研究表明肿瘤已经发展出各种方法来限制抗原的识别从而造成免疫逃逸,因此探讨肿瘤免疫逃逸的分子机制对肿瘤免疫治疗的相关策略有着重要的指导作用。癌症是一种疾病的集合,其特征是由基因突变引起的细胞生长异常和失控。约50%的肿瘤中存在p53突变,在肝癌中约有30%左右的患者发生p53突变。近年研究发现,p53突变参与了肿瘤免疫微环境的重塑,成为肿瘤发生的免疫驱动因素。因此本课题旨在明确p53突变在肝癌中的临床意义,并深入探讨p53突变与肝癌免疫逃逸的相关性,以及p53突变调控肝癌细胞免疫逃逸的具体机制,为肝癌的发生、发展过程以及治疗提供理论基础。研究方法:1.实验材料:人肝癌细胞系Hep3B和PLC/PRF/5、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、C57BL/6小鼠、OT-Ⅰ小鼠和NOD-SCID免疫缺陷小鼠。2.实验方法:(1)生物信息学分析:从TCGA获取肝细胞癌临床数据、表达数据以及突变数据,表型信息按照p53突变以及野生进行分组,提取265例肝癌患者临床病例资料用于后续统计分析。基于R环境使用Limma包进行差异基因分析,使用GSEA软件进行富集分析。(2)细胞培养:培养人肝癌Hep3B和PLC/PRF/5细胞系。(3)病毒转染:利用慢病毒表达系统技术分别在Hep3B细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53R249S作为实验组;在PLC细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。构建稳定过表达p53R249S突变的Hepa1-6小鼠肝癌细胞及过表达OVA的Hepa1-6-p53R249S细胞。(4)MTT实验:检测肝癌细胞的增殖能力。(5)克隆形成实验:检测肝癌细胞的克隆集落形成能力。(6)细胞划痕实验:检测肝癌细胞迁移能力。(7)小鼠皮下成瘤实验:利用稳定过表达p53R249S突变的Hepa1-6小鼠肝癌细胞及过表达OVA的Hepa1-6-p53R249S细胞进行皮下成瘤,检测肿瘤大小、重量和体积。(8)小鼠肿瘤组织淋巴细胞提取:利用肿瘤组织消化液和密度离心法提取小鼠皮下瘤体中的淋巴细胞。(9)人外周血CD8~+T细胞提取:取健康志愿者静脉血应用人淋巴细胞分离液收集外周血单个核细胞,随后利用磁珠分选和体外激活剂刺激得到CD8~+T细胞。(10)细胞共培养实验:将病毒转染后的人肝癌细胞与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析;OT-Ⅰ小鼠CD8~+T细胞与Hepa1-6-OVA-p53R249S小鼠肝癌细胞共培养用于后续LDH杀伤实验。(11)流式细胞术:检测小鼠皮下瘤体中的T淋巴细胞浸润情况以及瘤体CD8~+T淋巴细胞中颗粒酶B、穿孔素STM2457化学结构水平;检测小鼠皮下瘤体中H2K的表达;检测肝癌细胞表面与胞内MHC-Ⅰ的表达;检测细胞共培养后CD8~+T数量及CD8~+T中颗粒酶B、穿孔素水平。(12)LDH杀伤实验:计算CD8~+T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。(13)免疫组化:检测小鼠皮下瘤体组织中CD8及H2K的蛋白表达水平。(14)免疫荧光:用于检测MHC-Ⅰ与LC3在细胞中共定位情况。(15)实时荧光定量PCR:检测肝癌细胞中TAP1、TAP2、ERAP1、ERAP2、β2m、MHC-Ⅰ的m RNA水平;检测小鼠皮下瘤体组织中p53和H2K的m RNA水平。(16)蛋白质印迹实验:检测肝癌细胞中TAP1、TAP2、ERAP1、ERAP2、β2m、MHC-Ⅰ、LC3、p62、CDKN2A、BIRC5和SPHK1的蛋白水平;检测小鼠皮下瘤体组织中p53和H2K的蛋白水平。(17)透射电镜:用于观测自噬小体情况。(18)统计学分析:本实验所有数据使用软件SPSS 22.0完成统计,所有数据使用均数±标准差的形式进行展示,并且所有实验均完成三次独立重复实验。同时,本实验中的柱状图量化及折线图由Prism 9(Graph Pad Software)完成。正态分布资料两样本比较时采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。当P<0.05时,认为该数据具备统计学差异。3.实验方案:3.1肝癌细胞及组织中p53突变的临床意义(1)评估肝癌组织中p53突变情况,基于R4.1.2环境,对TCGA数据库中肝癌组织样本数据进行基因突变分析:对肝癌患者p53突变情况、p53突变的肝癌患者总生存期以及p53突变与临床病理特征的关系进行比较分析,明确肝癌组织中p53突变的临床意义。(2)应用慢病毒表达系统技术分别在Hep3B细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53R249S作为实验组;在PLC细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。随后通过MTT增殖实验、平板克隆形成、细胞划痕实验等评估肝癌细胞中p53突变对于肝癌细胞恶性行为的影响,明确肝癌细胞中p53突变的临床意义。(3)利用重度免疫缺陷小鼠模型判断p53R249S突变对无免疫功能小鼠中的皮下成瘤效果,构建了稳定过表达p53R249S突变的Hepa1-6小鼠肝癌细胞。将1×10~6的Hepa1-6-PLVX细胞作为对照组以及Hepa1-6-p53R249S细胞作为实验组接种于小鼠皮下,在出现可见瘤体后每间隔2天记录瘤体生长情况。瘤体生长第21天后将小鼠脱颈处死并取出皮下瘤拍照称重。3.2 p53R249S突变导致CD8~+T细胞免疫杀伤能力减弱(1)评估肝癌组织中p53突变与肿瘤免疫相关通路的相关性,从TCGA获取肝细胞癌临床数据、表达数据以及突变数据,从突变数据获取p53突变情况,筛选肿瘤组织,肿瘤样本按照p53突变以及野生型进行分组,基于R环境使用Limma包进行差异基因分析,使用GSEA软件进行免疫相关通路基因进行功能富集分析。(2)评估p53R249S突变对免疫细胞浸润的影响,将1×10~6的Hepa1-6-PLVX细胞以及Hepa1-6-p53R249S细胞接种于C57BL/6小鼠皮下。成瘤后第21天从瘤体组织中提取了淋巴细胞,利用流式细胞术分析瘤体里的CD45~+、CD3~+、CD8~+等免疫细胞浸润情况。(3)小鼠成瘤实验方法同上,利用体内中和抗体与免疫组化实验判断p53R249S突变促进瘤体生长依赖于CD8~+T细胞。(4)利用流式细胞术检测Hepa1-6-p53R249S小鼠皮下瘤体中CD8~+T细胞中的杀伤因子穿孔素与颗粒酶的表达情况。(5)利用磁珠分选技术提取CD8~+T细胞并刺激其分化成为成熟的T细胞后,与上述构建的人肝癌细胞系(p53R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比)共培养,流式细胞术和LDH杀伤实验检测CD8~+T细胞的功能,判断p53R249S突变是否调控CD8~+T细胞的免疫杀伤功能。(6)采用OT-Ⅰ小鼠模型并构建了表达OVA的Hepa1-6-p53R249S细胞,探究p53R249S突变是否影响CD8~+T细胞介导的针对肿瘤细胞表面OVA特异性小肽的免疫应答;利用流式细胞术、免疫组化、LDH杀伤实验等验证p53R249S突变是否调控特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫识别杀伤减弱。3.3 p53R249S突变通过自噬途径影响免疫杀伤功能:(1)评估p53R249S突变导致免疫杀伤能力减弱的具体原因,p53R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比,采用PCR、western blot、流式细胞术、免疫荧光等实验分析抗原提呈关键分子MHC-Ⅰ的分布与表达,探究p53R249S突变导致免疫识别过程受损的机制。(2)探究p53R249S突变影响MHC-Ⅰ表达的具体原因,通过western blot、免疫荧光共聚焦、流式细胞术明确p53R249S突变影响MHC-Ⅰ降解的机制。(3)评估自噬是否参与p53R249S突变介导的免疫杀伤功能减弱,利用流式细胞术、免疫组化、透射电镜、LDH杀伤实验以及自噬抑制剂氯喹明确p53R249S突变通过自噬途径影响MHC-Ⅰ造成免疫逃逸。(4)小鼠皮下成瘤实验探究抑制自噬对p53R249S突变介导的Torin 1说明书瘤体生长的影响。(5)利用R语言、western blot和PCR实验探究可能参与p53R249S突变调控自噬的关键基因。(6)利用流式细胞术检测应用氯喹后小鼠皮下成瘤中的CD8~+T细胞浸润情况及颗粒酶B和穿孔素表达情况,探究阻断自噬后能否逆转p53R249S突变导致CD8~+T细胞免疫杀伤功能失调。(7)采用OT-Ⅰ小鼠模型及流式细胞术、免疫组化、LDH杀伤实验等验证p53R249S突变是否通过自噬途径影响MHC-I类分子的特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫杀伤能力减弱。结果:第一部分:p53突变的肝癌细胞逃避了免疫监视导致不良预后生物信息学分析:1.肝癌患者中最常见的基因是p53突变(30%),p53R249S突变是肝癌患者中最常见的p53突变;2.p53突变肝癌患者比p53野生型的肝癌患者的总生存期和无病生存期显著缩短(P<0.005);3.p53突变与TNM分期,分化程度,门静脉浸润以及淋巴结转移都密切相关。体外细胞学实验:1.p53R249S突变促进肝癌细胞的增殖活力;2.p53R249S突变促进肝癌细胞生长出更多的克隆团落;3.p53R249S突变促进了肝癌细胞的迁移能力。小鼠体内实验:1.p53R249S突变的小鼠瘤体的体积和重量明显增加;2.p53R249S突变能够减弱无免疫功能小鼠中的成瘤效果。第二部分:p53R249S突变导致CD8~+T细胞免疫杀伤能力减弱生物信息学分析:GSEA分析发现肝癌组织中p53突变与抗原提呈、干扰素信号、TCR信号、细胞因子、先天免疫反应等免疫相关过程密切相关。小鼠体内实验:1.p53R249S突变导致的皮下瘤体中有更少的T淋巴细胞浸润,CD8~+T细胞占所有淋巴细胞比例明显下降;2.p53R249S突变促进瘤体生长依赖于CD8~+T细胞;3.p53R249S突变能够导致瘤体中CD8~+T细胞表达更少的颗粒酶B和穿孔素;4.p53R249S通过影响MHC-I类分子的特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫杀伤减弱。体外细胞学实验:1.p53R249S突变能够导致CD8~+T细胞的杀伤效率降低;2.p53R249S突变抑制CD8~+T细胞的免疫杀伤功能。第三部分:p53R249S突变通过自噬途径影响免疫杀伤功能体外细胞学实验:1.p53R249S突变没有改变MHC-Ⅰ的m RNA表达水平,但是能够导致MHC-Ⅰ的蛋白水平有所减弱(P<0.05);在正常肝细胞中MHC-Ⅰ蛋白均正常表达于细胞膜上和胞质中,而p53R249S突变的Hep3B细胞膜表面只表达较少的MHC-Ⅰ蛋白;2.p53R249S突变通过自噬途径导致MHC-Ⅰ降解增多。3.p53R249S突变促进自噬导致MHC-I类分子降解增多从而无法有效地提呈于膜表面。生物信息学分析:CDKN2A和SPHK1是p53R249S突变促进自噬的关键基因。小鼠体内实验:1.抑制自噬能够减弱p53R249S突变介导的瘤体的生长;2.抑制自噬恢复p53R249S突变介导的CD8~+T细胞功能失调;3.p53R249S突变是通过自噬途径影响MHC-I类分子的特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫杀伤能力减弱。结论:1.p53R249S突变是肝癌患者中最常见的p53突变,p53R249S突变导致肝癌不良预后是因为发生了免疫逃逸。2.p53R249S突变通过影响MHC-I类分子的特异性抗原提呈作用造成了免疫杀伤功能减弱。3.p53R249S突变通过自噬途径降解MHC-Ⅰ类分子促进免疫逃逸。