白僵菌素(beauvericin,BEA)是一种新兴的真菌毒素,是由镰刀菌、球孢白僵菌等产毒真菌产生的次级代谢产物,广泛存在于各种大麦、小麦、大米、玉米和谷物制品中。有研究报道BEA具有强烈的肝毒性,肝脏是机体重要的代谢调控和解毒中心,因此有必要深入研究BEA肝毒性的具https://www.selleck.cn/products/ag-221-enasidenib.html体作用机制。活性氧(ROS)介导的氧化应激参与了 BEA诱导的细胞毒性,核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)是维持氧化还原稳态的重要核转录因子。研究显示氧化应激产生的ROS以及Nrf2信号通路均能影响自噬的发生。ROS-Nrf2信号通路介导的细胞自噬是否参与BEA诱导的肝细胞毒性损伤有待研究。本试验以BRL3A细胞(大鼠肝细胞系)为研究对象,探究了 BEA对细胞氧化应激、Nrf2信号通路的影响,以及ROS-Nrf2与自噬信号之间的关系在BEA诱导的肝细胞毒性损伤中的作用。1 BEA致BRL3A细胞氧化损伤为探究BEA对大鼠肝细胞毒性损伤的影响,本试验将不同浓度BEA(0、0.5、1、1.5、2、3和4μmol/L)作用于BRL3A细胞12 h,通过CCK-8法和LDH释放法检测细胞活率;倒置显微镜观察细胞形态变化以及透射电镜观察细胞超微结构改变;荧光显微镜和流式细胞术测量细胞内ROS和超氧化物阴离子水平,试剂盒检测氧化损伤相关指标。结果显示,随着BEA剂量增加,细胞活率下降,LDH释放增多,细胞呈现皱缩状态,最终选用0、1、1.5和2μmol/LBEA作用于BRL3A细胞12 h。透射电镜图像显示,BEA破坏细胞核和线粒体结构。此外,BEA显著升高细胞内ROS和MDA含量(P<0.05),超氧化物阴离子水平也升高;BEA剂量依赖性增高GSH-Px活性,而CAT、T-SOD活性和GSH含量呈现先上升后下降趋势。结果表明,BEA诱导细胞氧化应激,发生氧化性损伤,降低细胞活力。2 BEA致BRL3A细胞自噬为探究细胞自噬是否参与BEA诱导的BRL3A细胞毒性损伤,首先将不同浓度BEA(0、1、1.5和2μmol/L)作用于BRL3A细胞12h,采用qRT-PCR检测自噬相关基因转录;Western blot检测自噬相关蛋白表达;免疫荧光检测LC3聚点;透射电镜观察自噬小体生成;BEA分别联合自噬抑制剂CQ、促进剂RAPA以及ROS清除剂NAC探究其对细胞自噬的作用。结果显示,BEA显著激活自噬相关基因Beclin1、SQSTM1的转录(P<0.05);自噬标记蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG5的表达均显著升高(P<0.05);LC3呈点状聚集分布在细胞核周围;BEA促进自噬小体生成增多。BEA分别联合CQ和RAPA,与BEA单独组相比,BEA+CQ处理组LC3 Ⅱ/Ⅰ、ATG5和p62的表达水平显著下降(P<0.05),细胞活率上升;BEA与RAPA共处理组LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62和Beclin1蛋白的表达量明显升高(P<0.05),细胞活率降低,提示CQ和RAPA分别抑制或促进BEA诱导的细胞自噬。与单独BEA组相比,NAC与BESerratia symbioticaA共孵育后有效降低细胞内ROS水平,在此基础上检测NAC对细胞自噬的影响,发现与BEA组相比,加入NAC后显著抑制自噬相关蛋白的表达(P<0.05),LC3聚点数量也减少,呈弥散分布。以上结果表明,BEA诱导BRL3A细胞自噬发生,且这一过程是由ROS介导的。3 ROS-Nrf2通路在BEA致BRL3A细胞自噬中的作用为阐明ROS介导的氧化应激、Nrf2信号通路和自噬之间的关系在BEA诱导的肝细胞毒性损伤中的作用,首先探究了 BEA对BRL3A细胞Nrf2信号通路的影响,将不同浓度BEA(0、1、1.5和2μmol/L)处理细胞12 h,Western blot检测Nrf2信号通路相关蛋白表达变化,qRT-PCR检测Nrf2下游抗氧化基因的转录水平,免疫荧光监测Nrf2核转位,再联合NAC检测ROS在BEA诱导Nrf2信号通路变化中的作用;其次,BEA联合Nrf2抑制剂ML385和激活剂CDDO探究Nrf2信号通路对细胞自噬的影响。结果显示,不同浓度BEA显著降低Keap1表达量(P<0.05),促进NQO1和HO-1蛋白表达,细胞核内Nrf2蛋白表达升高,Nrf2入核明显。BEA联合NAC处理细胞,与单独BEA组相比,NAC显著抑制NQO1和核蛋白Nrf2的表达(P<0.05),HO-1表达也下降,Nrf2入核减少。上述结果表明BEA通过ROS介导激活Nrf2信号通路。BEA与ML385联合处理寻找更多后,与单独BEA组相比,细胞活力显著升高(P<0.05),减弱了 BEA对Nrf2信号通路的活化效应,降低自噬水平;然而,BEA联合CDDO处理后呈现相反趋势,表明BEA诱导的自噬激活是由Nrf2介导的。以上结果表明,ROS介导的Nrf2信号通路正向调节BEA诱导的细胞自噬,BEA通过ROS-Nrf2-自噬轴参与诱导肝细胞毒性损伤。结论:BEA诱导大鼠肝细胞氧化应激,引起氧化性损伤,ROS介导的氧化应激在BEA激活的细胞防御反应中起作用。BEA激活细胞Nrf2信号通路和自噬,且自噬激活是由ROS-Nrf2通路介导的,二者的激活进一步加剧BEA诱导的肝细胞毒性损伤。