研究背景急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是一种起源于造血系统的恶性克隆性疾病,阿糖胞苷联合蒽环类药物的“7+3”诱导化疗方案以及缓解后大剂量阿糖胞苷巩固治疗,仍然是除急性早幼粒白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)外的初诊AML患者的首选治疗方案。然而,由于AML存在高度异质性,“7+3”方案在不同患者中的治疗效果差异较大,近些年陆续出现的分子靶向药物也仅对特定基因类型的患者有效,因此AML治疗仍存在未被满足的需求,亟需寻找新型治疗药物。表观遗传调控异常在AML发生发展中发挥重要的作用。通过对AML中表观遗传学修饰的研究,发现与其发生发展密切相关的表观遗传调控分子,可以作为潜在的干预AML疾病进程的靶点。组蛋白修饰是一种重要的表观遗传学修饰,自20世纪60年代发现以来,有大量其在癌症中作用被报导。课题组前期通过化合物库筛选,发现了组蛋白甲基转移酶SETD8抑制剂UNC0379在三种非APL的AML细胞系中均可达到90%以上的抑制率,因此锁定组蛋白甲基转移酶SETD8作为研究对象。数据分析发现SETD8在AML患者样本中高表达,并且高表达的SETD8与AML患者不良预后相关,表明SETD8与AML发生发展相关。之前有研究发现,在不同类型的肿瘤中,SETD8异常表达可以促进或抑制不同肿瘤的进展。然而,SETD8在AML发生发展中的作用及调控机制尚不清楚,本研究拟探究SETD8在AML,尤其是非APL的AML发生发展中的作用,以期为基于SETD8为靶点的AML干预策略提供依据。近些年的研究表明精准治疗已成为AML治疗的趋势,而精准治疗的基础是精准判断患者的预后。目前AML的预后判断主要采用欧洲白血病网络(European Leukemia Net,ELN)基于染色体异常、融合基因和基因突变的风险分层,但该风险分层并未考虑到AML患者转录组水平基因表达的异质性对患者预后产生的潜在影响。因此,有必要构建包括基因表达信息在内的综合评分系统,对患者预后进行个体化评估。近年来,随着生物信息学理论与技术的迅速演进,基于基因芯片与二代测序所产生的转录组、基因组等组学大数据的数量呈指数级上升,利用生物信息学方法分析这类大数据,可以高效准确地区分患者的分子亚型,并建立准确的预后预测模型,从而制定个性化治疗方案,具有广阔的应用前景。铁死亡是一种常见的程序性细胞死亡方式。发生铁死亡的细胞具有独特的形态学特征,表现为线粒体在体积缩小的同时,线粒体嵴减少并伴外膜破裂。铁死亡的主要分子机制包括胞内铁过载、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平升高、脂质过氧化,以及细胞内还原性化合物谷胱甘肽(Glutathione,GSH)耗竭等。自2012年Scott J Dixon提出铁死亡以来,铁死亡相关基因获得了广泛关注。铁死亡相关基因在代谢性疾病、心血管疾病、神经系统疾病以及肿瘤中发挥着重要作用。基于铁死亡相关基因的分子亚型以及预后模型已经在乳腺癌、结肠癌以及膀胱癌等显示出良好的预测价值,但铁死亡相关分子亚型以及预后模型在AML中尚缺乏研究。有鉴于此,本研究拟探索铁死亡相关基因对于AML患者预后的预测意义。研究目的(一)探索含SET结构域的赖氨酸甲基转移酶-8(SETD8)在AML发生发展中的作用与机制。(二)基于AML公共数据集,利用铁死亡相关基因,以生物信息学方法构建预测患者预后的多变量风险比例回归(Proportional Hazard,又称COX)模型。方法和结果(一)下调SETD8可通过降低CXCR4启动子区H4K20me1甲基化水平,进而降低CXCR4表达,从而抑制AML细胞增殖并诱导细胞凋亡。1.前期通过小分子化合物库筛选,我们鉴定出组蛋白甲基转移酶SETD8的选择性抑制剂UNC0379可抑制三种AML细胞系(U937,THP1,KASUMI-1)增殖,并且抑制率均大于90%。生信分析与标本检测发现SETD8在初诊AML患者中高表达,且与不良预后有关。这些结果提示SETD8与AML密切相关。2.构建SETD8稳定敲低的白血病细胞U937和Kasumi-1,CCK-8和EdU实验检测到敲低SETD8显著抑制AML细胞增殖。流式细胞术检测发现,敲低SETD8促进AML细胞凋亡,Western blot实验显示,敲低SETD8后的AML细胞抗凋亡相关蛋白Bcl-2水平降低、凋亡活化相关标记物Cle-caspase3,Cle-parp1等水平增高。通过死亡信号通路相关抑制剂筛选,发现只有凋亡信号通路相关的抑制剂Z-VAD-FMK可以回复SETD8引起的增殖受抑。上述结果表明抑制SETD8通过诱导AML细胞凋亡发挥作用。3.使用p53抑制剂PFT-α处理SETD8敲低的AML细胞系,发现抑制p53无法逆转SETD8敲低对AML细胞增殖的抑制以及对细胞凋亡的促进作用,表明SETD8通过非p53依赖的凋亡途径发挥作用。4.通过CCK8实验以1-10μM UNC0379浓度在AML细胞中进行半数抑制浓度(IC50)的筛选,确定UNC0379在U937和Kasumi-1细胞中半数抑制浓度分别是7μM(U937)和4μM(Kasumi-1),并使用该浓度,验证了UNC0379可显著抑制AML细胞增殖并促进其凋亡。5.使用C1498细胞系构建了小鼠AML模型Biomass pyrolysis,通过注射SETD8敲低细胞或使用SETD8抑制剂UNC0379处理小鼠后,发现两种方法均可减缓小鼠体内的白血病进展、减轻白血病细胞在内脏器官的浸润,并延长患病小鼠的生存时间。6.对SETD8敲低的U937细胞及未处理的U937细胞进行RNA-seq测定,富集分析发现差异基因涉及到多个和凋亡、癌症有关的信号通路。结合TCGA和BeatAML公共数据库中与SETD8表达呈正相关的基因,同自测的RNA-seq差异基因取交集,交集基因中发现CXCR4在SETD8敲低细胞系中显著降低,且与SETD8的表达呈现正相关。进一步使用Western Blot和PCR验证发现,敲低SETD8可以导致CXCR4的mRNA和蛋白表达水平均发生降低。表明CXCR4可能作为SETD8的下游靶分子。7.通过WASHU网站发现,CXCR4启动子上游2kb区域之内存在组蛋白H4K20me1的富集区。采用Western blot检测发现,敲低SETD8或加入其抑制剂UNC0379均能下调AML细胞中H4K20me1的蛋白水平。Chip-qPCR结果表明,敲低SETD8或者使用其抑制剂UNC0379较对照组能显著降低细胞中CXCR4启动子上游附近H4K20me1的富集水平。表明SETD8通过调节CXCR4启动子区的H4K20me1水平,发挥影响CXCR4转录表达的作用。8.通过CCK-8以及EdU回复实验,发现在AML U937和Kasumi-1细胞中过表达CXCR4或者使用CXCR4的激动配体SDF-1α可以逆转敲低SETD8对AML细胞增殖能力的抑制作用。流式检测发现,在SETD8敲低细胞系中使用SDF-1α也会导致AML细胞中凋亡水平的下降。进一步验证了在AML中SETD8通过调控CXCR4来发挥其生物学效应。(二)结合AML公共数据集和铁死亡基因集,构建AML铁死亡相关基因的分子亚型。并在此基础上,通过亚型相关的13个差异基因构建AML预后模型,结合患者年龄以及突变相关信息,构建预后相关列线图。1.对TCGA数据集中的259个铁死亡相关基因进行了单变量COX回归。选择具有预后意义的47个基因进一步分析,使用无监督聚类的方法根据基因表达数据将TCGA数据集的患者分为C1和C2两个亚型,共识CDF曲线和Nbclust算法和PCA分析确定了两个亚型存在明显差异性。使用组内比例算法,验证GEO合并数据集中存在与TCGA数Emricasan配制据集相似的C1和C2亚型分布。2.在TCGA数据集中比较了C1和C2两种亚型的临床基线资料的差异。C1亚型中更多样本属于细胞遗传学风险好的亚组,C2亚型中FAB分型M5患者比例较高而M3患者比例较少、且白细胞水平显著升高。在TCGA和GEO合并数据集中对两种亚型进一步分析,生存分析显示,C2亚型表现出较差的预后。肿瘤浸润分析显示,C1亚型具有更高百分比的CD8+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和更强的Ⅰ型干扰素反应,以及更低百分比的调节性T细胞。突变分析显示,C1亚型中的RUNX1突变频率更高,C2亚型显示更高频率的FLT3-ITD和NPM1突变。GSVA分析发现,C2亚型中ERBB、TGF-β和KRAS等促癌信号通路上调、P53和G2M检查点等癌症抑制通路下调。铁死亡相关信号通路中硒氨基酸代谢通路在C2中上调,过氧化物酶体通路在C2中下调。3.用C1、C2亚型作为分组,寻找两组间的差异基因,对差异基因进行Lasso-COX联合分析,得到了一个多变量COX预后风险模型,由13个基因组成,根据13个基因的表达值以及风险系数计算评分。在训练集和多个验证集中通过时间依赖的ROC曲线验证其预测能力。通过与已报道的三种AML预后模型比较发现,该风险评分预测预后的能力更好。泛癌分析显示该风险评分对弥漫大B细胞淋巴瘤、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌、皮肤黑色素瘤、以及甲状腺癌也具有较好的预后预测能力。4.纳入多个临床基线指标以及风险评分,经多变量COX回归分析发现,风险评分、年龄、FLT3-ITD、RUNX1和TP53是独立预后因素,通过整合年龄、相关突变和风险评分,我们构建了一个列线图,该列线图对AML患者确诊后1年、2年及3年的生存显示出良好的预测性。该列线图使用TCGA为训练集,BeatAML为外部验证集,均显示出较好的预测能力与较高的准确度。5.将患者按照风险评分高低分为高风险和低风险两组后,比较两组的基线特征,发现两组间在发病年龄、骨髓原始细胞百分比、外周血白细胞计数、FAB分型、细胞遗传学和分子风险分类方面均有显著差异。还发现高风险组患者的抗铁死亡基因GPX4表达水平更高,携带FLT3-ITD和DNMT3A突变的患者具有更高的风险评分。比较高风险组和低风险组的免疫特征,发现在低风险组CD8+T细胞、共刺激T细胞、TIL和Ⅰ型IFN反应更高。高风险组调节性T细胞水平升高。6.利用细胞系数据库CTRP药物敏感性分析,发现低风险组对阿糖胞苷、多柔比星和依托泊苷等传统细胞毒药物以及BCL-2抑制剂维奈托克更敏感。高风险组对地西他滨和阿扎胞苷等去甲基化药物(Hypomethylating agents,HMAs)以及伏立诺他(Vorinostat)等组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi)更敏感。此外,还发现高表达GPX4的高风险组对抑制GPX4诱导铁死亡的RSL3和ML210的敏感性更高。这些结果在人源的TCGA数据集中也得到进一步验证。研究结论(一)本部分研究发现,组蛋白甲基转移酶SETD8在AML中表达上调,且与AML预后不良相关。SETD8可通过增加CXCPidnarulex体内R4启动子区域H4K20me1的甲基化水平从而增强CXCR4转录,增加AML细胞增殖的同时抑制凋亡,进而促进AML的发生发展。此研究可为开发基于SETD8为靶点的AML干预策略提供依据。(二)在本部分研究中,利用AML公共数据及铁死亡基因集,构建AML铁死亡相关的两种亚型,并在此基础上建立了与铁死亡有关的13基因风险模型,计算了风险评分并确定风险分组。风险评分在多个外部验证集中以及同多个已报道的AML预后模型的比较中,都表现出较好的预后预测能力。而风险分组还可预测药物敏感性,用于指导疾病治疗。