目的:失血性休克是一种低血容量性休克,严重失血导致组织缺血缺氧。液体复苏会引起缺血再灌注损伤。细胞缺氧及复氧诱导的炎症反应是缺血再灌注损伤的重要机制。巨噬细胞是固有免疫的核心组成部分,对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)敏感,过度分泌多种炎症因子引起重要脏器的损伤。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体作为炎症反应的重要组成,主要表达于巨噬细胞中。NLRP3炎症小体活化后,引起细胞焦亡,分泌IL-1β和IL-18,导致过度的炎症反应。近期有证据表明,H/R巨噬细胞RAW264.7中NLRP3炎症小体活化,诱导过度的炎症反应。然而,目前尚无有效的药物抑制HS后液体复苏导致的缺血再灌注损伤,对于H/R诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化也没有有效的靶点。Hasan B.Alam课题组发现在失血性休克动物模型中,组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylases 6,HDAC6)特异性抑制剂妥巴司汀A(Tubast寻找更多atin A,Tub A)可以有效提高HS时大鼠的存活率,减轻重要脏器的损伤。此外,在脓毒症的模型中,他们发现Tub A可以有效抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和尼日利亚菌素联合刺激诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化。然而,其具体机制尚不清楚。Tub A通过抑制巨噬细胞RAW264.7中HDAC6,进而抑制热休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)。抑制巨噬细胞中Hsp90导致诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS),活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)含量降低。而在缺氧/复氧的巨噬细胞中,降低ROS含量,可以抑制NLRP3炎症小体活化。因此,Tub A可能通过抑制H/R巨噬细胞中HDAC6,抑制Hsp90,进而抑制i NOS,导致ROS的生成减少,削弱NLRP3炎症小体活化。本研究通过构建巨噬细胞H/R模型,探索Tub ATezacaftor分子量对H/R巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的影响。研究方法:本研究以巨噬细胞RAW264.7作为体外研究对象。首先使用CCK8检测0、2.5、5、10μM Tub A下缺氧6h/复氧6h巨噬细胞RAW264.7活性,以选择Tub A的适宜干预浓度。随后将巨噬细胞RAW264.7随机分为三组(1)Ctrl组:先21%O_2下饥饿培养基培养6h,后21%O_2下完全培养基培养6h;(2)H/R组:先1%O_2下饥饿培养基培养6h,后21%O_2下完全培养基培养6h先缺氧6h后复氧6h;(3)Tub A组:缺氧6h加复氧6h的同时给予2.5μM Tub A治疗。荧光显微镜观察细胞内ROS含量变化。Western Blot法检测细胞内HDAC6、Hsp90、i NOS、NLRP3、GSDMD、Caspase-1,GSDMD-N、Caspase-1 p20表达。ELSIA法检测细胞培养液中的细胞因子IL-1β和IL-18水平。结果:(1)选择2.5μM Tub A对H/R巨噬细胞RAW264.7进行干预。(2)与Ctrl组相比,H/R组细胞中HDAC6、Hsp90、i NOS表达显著增加。与H/R组相比,Tub A组HDAC6、Hsp90、i NOS表达显著减少。(3)与Ctrl组相比,H/R组细胞中ROS含量增加。与H/R组相比,Tub A组ROS含量减少。(4)与Ctrl组相比,H/R组细胞中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、Caspase-1 pinternal medicine20表达显著增加。与H/R组相比,Tub A组NLRP3、GSDMD、Caspase-1,GSDMD-N、Caspase-1 p20表达显著减少。(5)与Ctrl组相比,H/R组细胞上清液中IL-1β和IL-18的分泌显著增加。与H/R组相比,Tub A组IL-1β和IL-18的分泌显著减少。结论:本研究发现HDAC6特异性抑制剂Tub A可以抑制H/R巨噬细胞中HDAC6,Hsp90,i NOS的表达,减少ROS的含量,进而抑制NLRP3炎症小体活化,减少IL-1β和IL-18分泌。